قصل دوم - سیستم های الایزا

فصل 2

 

 

سیستم های الایزا

این بخش واژه ها و پیکربندی بیشتر کاربردهای الایزا را تعریف کرده و بررسی میکند.چنین  بخشی مهم است چون فهم تواناییهای نهفته در سیستم های الایزا سبب میشود تا کاربرد آنها در طراحی سنجش بیشتر شود.همه سیستم های ناهمگون سه پارامتر پایه ای دارند.

1. یک واکنشگر، به فاز جامد که معمولا یک پلیت میکروتیتر با چاچوب 8*12 است میچسبد.
2.  ریاجنتها پی درپی به فاز جامدی که یک ماده به آن چسبیده است ا فزوده میشوند و با یک مرحله شستشوی ساده اجزای متصل و ازاد از هم جدا میشوند.
3. نتیجه به صورت تشکیل رنگ بدست میاید.

تعریف واژه ها

ایمونواسی به ازمایش هایی گفته میشود که از انتی بادی ها به عنوان ریاجنت استفاده میکند.انزیم ایمونواسی از انزیم های متصل به یکی از واکنشگرها استفاده میکند و با ایجاد رنگ پس از اضافه کردن یک سوبسترا/رنگزای مناسب اندازه گیری فراهم میشود.

همانطور که مشخص شد الایزا شامل افزودن گام به گام ریاجنتها به مواد متصل به فاز جامد است و واکنش از طریق اینکوباسیون و جداسازی ریاجنتهای متصل و ازاد از هم با استفاده از مراحل شستشو انجام می شود.

از یک واکنش انزیمی استفاده شده و رنگ ایجاد میشود و اندازه گیری واکنش با استفاده از یک واکنشگر متصل به انزیم انجام میشود. جدول 1 تعریف واژه های الایزا را ارایه میدهد.این واژه ها در تمام این نوشتار استفاده میشوند.

 

فاز جامد: معمولا یک چاهک پلیت میکروتیتر. پلیتهای الایزا بصورت اختصاصی تهیه شده و بصورت تجاری دردسترس میباشند.این ها یک چارچوب 8*12 چاهکی داشته و به همراه تجهیزاتی که بطور اختصاصی به منظور کار با نمونه ها طراحی شده اند مانند پی پتهای چند کاناله ، بکاربرده میشوند.   

جذب سطحی : فرایند افزودن یک انتی ژن یا انتی بادی رقیق شده در یک بافر و چسبیدن آن به بطور غیر فعال به فاز جامد درطی اینکوباسیون است . این یک روش ساده برای ثابت سازی یکی از واکنشگرها در الایزا است و از اصلی ترین علتهای موفق بودن الایزا است.

شستشو : پر و خالی کردن ساده ریاجنتها با یک محلول بافری برای جدا کردن ریاجنتهای متصل (واکنش داده ) از ریاجنتهای متصل نشده (واکنش نداده ) در الایزا . و باز هم این یک عنصر کلیدی در بهره گیری موفق از الایزا است .

انتی ژن : یک پروتیین یا کربوهیدرات که هنگام  تزریق به حیوانات تولید انتی بادی ها را بر می انگیزد.چنین انتی بادی هایی می توانند بصورتی اختصاصی با انتی ژن بکار رفته واکنش دهند و بنابراین می توانند در تشخیص انتی ژن استفاده شوند.

انتی بادی : در پاسخ به تحریک های انتی ژنی تولید میشوند.این ها در اصل ، پروتیین هستند . همچنین انتی بادی ها می توانند به نوعی انتی ژن باشند.

انتی بادی های ضد گونه : هنگامی که  پروتیین های یک گونه (شامل انتی بادی ها ) به گونه دیگر تزریق میشوند انتی بادی های ضد گونه تولید میشوند.بنابراین سرم خوکچه هندی که به یک خرگوش تزریق میشود تولید انتی بادی های خرگوشی ضد خوکچه هندی را بر می انگیزاند.

انزیم : ماده ای که می تواند در غلظتهای کم به عنوان یک کاتالیست عمل کرده و یک واکنش خاص را سرعت بخشد.چند انزیم خاص معمولا در الایزا به همراه سوبستراهای اختصاصی شان استفاده میشوند.

انزیم کنژوگه : یک انزیم که بطور برگشت ناپذیر به یک پروتیین ، معمولا یک انتی بادی متصل شده است.بنابراین یک مثال از انزیم کنژوگه ضد گونه انتی بادی خرگوشی ضد خوکچه هندی است که به انزیم پراکسیداز متصل شده است.

سوبسترا : یک ترکیب شیمیایی که انزیم بصورت اختصاصی با آن واکنش میدهد .این واکنش به شیوه ای برای ایجاد سیگنال استفاده شده و به صورت یک واکنش رنگی خوانده میشود ( یا بطور مستقیم با تغییر رنگ خود سوبسترا و یا بطور غیر مستقیم با اثر آن بریک ماده شیمیایی دیگر).

کروموفور: ماده ای شیمیایی که رنگ آن در نتیجه واکنش انزیم با سوبسترا تغییر میابد.

متوقف کردن : فرایند متوقف کردن عمل یک انزیم بر یک سوبسترا .این فرایند اثری متوقف کننده بر تغییر بیشتر رنگ در الایزا دارد.

خواندن : اندازه گیری رنگ ایجاد شده در الایزا . این اندازه گیری با استفاده از اسپکتروفتومترهایی خاص انجام میشود که طول موج های خاص رنگهای بدست امده از یک سیستم انزیم – کروموفور را می خواند. ازمایشها با چشم نیز قابل بررسی هستند.

 

سیستم های پایه ای الایزا

این بخش اصول بسیاری از پیکربندی های ممکن در الایزا را شرح میدهد.واژه شناسی استفاده شده در اینجا ممکن است با آنچه که دیگران استفاده میکنند یکسان نباشد و لازم است که در تعریف سنجش ها تنها به وسیله نام دقت شود.پارامترهای اختصاصی یک سنجش همیشه به دقت باید در نوشتار بررسی شود.

مجموعه تعریفهای ذیل تلاش میکند تا شیوه های بیشمار معرفی شده در توصیف سیستم ها ی مورد استفاده را با شمار کمی واژه بیان کند به عنوان مثال الایزای رقابتی ساندویچی دوتایی و الایزای مهاری ساندویچ غیر مستقیم .هدف این است که یک شیوه روشنی داشته باشیم.سه روش اصلی ، پایه تمام الایزا ها را شکل میدهد.

1. الایزای مستقیم
2. الایزای غیر مستقیم
3. الایزای ساندویچ

هر سه این سیستم را می توان به عنوان پایه برای گروهی از سنجش ها به نام الایزا های رقابتی یا مهاری مورد استفاده قرار داد.

سیستم ها ( یعنی ترتیب و کاربری ریاجنتها در تست) از این به بعد با استفاده از نماد ها (همانطور که در جدول 2 تعریف شده است ) و واژه ها نمایش داده میشوند.با این شیوه امید است  که خواننده دیدگاه روشنی از سیستم های مختلف و مزیتها و معایب نسبی آن بدست آورد. ویژگی کلیدی الایزا دراین است که بیشتر از یک سیستم را می توان در اندازه گیری یک انالیت یکسان بکار گرفت. این علاوه بر اینکه اجازه میدهد تا سنجش ها را با ریاجنتهای موجود متناسب کنیم، توجه ما را جلب زمینه های بهبود بخشیدن سنجش به وسیله دیگر ریاجنتها هم میکند به عبارت دیگر اینکه تولید مونوکلونال انتی بادی هایی ممکن است برای سنجش مورد نظر اختصاصیت بیشتری را فراهم کند ،یا اینکه کنژوگه ضد گونه ویژه ای بر ضد یک زیرکلاس از ایمونوگلوبولین ،لازم به نظر برسد.

 

جزئیات عملی مراحل مختلف مانند فاز جامد ،بافرها ،اینکوباسیون،و کنژوگه ها با جزئیات بیشتر در فصلهای 3 و 4 بررسی میشوند.

 

الایزای مستقیم

الایزای مستقیم را می توان به عنوان ساده ترین شکل الایزا در نظر گرفت که در شکل 1 و در طرح ذیل نمایش داده شده است.

 الایزای مستقیم:انتی ژن با جذب غیرفعال به فاز جامد می چسبد.پس از شستشو انتی بادی های نشاندار شده با انزیم اضافه میشوند. بعد از یک دوره اینکوباسیون و شستشو، یک سیستم سوبسترا یی اضافه میشود و اجازه داده میشود که رنگ ایجاد شود.

انتی ژن در یک بافر(مرحله i) که معمولا یک بافر کربنات /بیکربنات با پ هاش بالا (9.6) ویا بافر فسفات نمکی (PBS) است رقیق میشود. نکته کلیدی این است که بافر نباید حاوی پروتیین های دیگر نباشد چرا که ممکن است با انتی ژن مد نظر در چسبیدن به فاز جامد پلاستیکی رقابت کند.انتی ژنها اساسا ماهیت پروتیینی دارند و به طور غیر فعال به پلاستیک طی یک دوره اینکوباسیون می چسبند.دما و زمان اینکوباسیون آنقدر مهم نیست اما استاندارد سازی شرایط بسیار حیاتی است و استفاده از اینکوباتورهای 37 درجه سانتی گراد مناسب است (از آنجایی که در ازمایشگاهها بطور گسترده موجود هستند ) . بعد از اینکوباسیون ،بقیه انتی ژن اضافی را می توان با یک مرحله شستشوی ساده (مرحله ii) با پر کردن و خالی کردن چاهک ها با استفاده از محلول بافری خنثی ( مانند PBS) حذف کرد.اکنون انتی بادی های کنژوگه شده با یک انزیم می توانند اضافه شوند (مرحله iii) و بطور اختصاصی بر ضد مکانهای انتی ژنی روی ریاجنت متصل به فاز جامد هدایت شوند.انتی بادی های کنژوگه شده، در یک بافر حاوی موادی که مانع جذب غیر فعال پروتیین است ولی مانع اتصال ایمونولوژیک نمیشود، رقیق میشوند .چنین موادی یا ازجنس پروتیین های دیگر است که در غلظتهای بالا اضافه میشوند تا با مکان های فاز جامد ،با پروتیین انتی بادی رقابت کند یا دترجنتهایی هستند که در غلظتهای پایین اضافه شده و عوامل مسدود کننده نامیده میشوند،بافرها نیز می توانند به فرمول آنها کمک کنند که در این صورت بافرهای مسدود کننده نامیده میشوند.

طی اینکوباسیون انتی بادی ها به انتی ژن متصل میشوند . دوباره با یک مرحله شستشوی ساده انتی بادی های غیر متصل (مرحله 4) حذف میشوند.مرحله 5 شامل اضافه کردن یک سوبسترای مناسب یا ترکیبی از سوبسترا / کروموژن برای انزیم متصل به انتی بادی ها است .هدف این است که یک واکنش رنگزا از طریق کاتالیز انزیمی ایجاد شود.واکنش برای مدت زمان معینی پیش میرود و پس از آن واکنش  با تغییر پ هاش (مرحله 6) سیستم و یا اضافه کردن یک مهارکننده متوقف میشود.نهایتا رنگ با استفاده از یک اسپکتروفتومتر (مرحله 7) در طول موج مناسب رنگ ایجاد شده ،تعیین مقدار میشود.

این نوع از سیستم وقتی که تنها به این شکل استفاده شود محدودیتهای شدیدی دارد ،اما در سنجشهای رقابتی و مهاری سیستمی اصلی بوده ودارای اهمیت ویژه ای هستند به ویژه هنگامی که منوکلونال انتی بادی ها کنژوگه میشوند و یا انتی ژن های بسیارمشخصی مورد استفاده قرار می گیرند.

 

الایزای غیر مستقیم

الایزای غیر مستقیم درطرح 2 و در شکل 2 نشان داده شده است. مراحل 1 و 2 مشابه سیستم الایزای مستقیم است.مرحله 3 شامل اضافه کردن انتی بادی های تشخیص دهنده غیرنشاندار است که در بافری رقیق شده اند که از اتصال غیر اختصاصی پروتیین ها موجود در انتی سرم، به فاز جامد جلوگیری مب کند (بافر مسدود کننده).این مرحله با اینکوباسیون و شستشوی انتی بادی های اضافی(غیرمتصل) دنبال میشود تا فقط اتصالات اختصاصی داشته باشیم.(مرحله 4).مرحله 5 اضافه کردن انتی بادی های کنژوگه شده(نشاندار شده با انزیم) ضد گونه است که در یک بافر مسدود کننده رقیق شده اند و مجددا با اینکوباسیون و شستشو دنبال میگردد تا به اتصال کنژوگه دست یابیم (مرحله 6).سوبسترا / کروموفور بعد از آن به کنژوگه متصل شده اضافه میشود (مرحله 7) و رنگ ایجاد میشود که سپس متوقف شده (مرحله 8) وبا یک اسپکتروفتومتر خوانده میشود (مرحله 9).

سیستم الایزای غیر مستقیم شبیه به سیستم الایزای مستقیم است از این نظر که انتی ژن مستقیما به فاز جامد می چسبد و با انتی بادی های اضافه شده (انتی بادی های تشخیص دهنده) مورد هدف قرار میگیرند.اگرچه این انتی بادی های اضافه شده نشاندار شده با انزیم نیستند اما خودشان با انتی بادی های متصل به انزیم مورد هدف قرار میگیرند. چنین انتی بادی های ضد ایمونوگلوبولین گونه ها به همان صورتی تولید میشوند که انتی بادی های تشخیص دهنده تولید میشوند و کنژوگه های ضد گونه

 

 نامیده میشوند.بنابر این اگر انتی بادی های تشخیص دهنده در خرگوش تولید شدند انتی بادی های نشاندار با انزیم ، باید ایمونوگلوبولین های ضد ایمونوگلوبولین خرگوش باشند.استفاده از کنژوگه های ضد گونه انعطاف پذیری بزرگی به سیستم می دهد چرا که کنژوگه هایی با خصوصیات مختلف را میتوان جهت تشخیص اتصال ایمونوگلوبولینها بکار گرفت و واقعا هزاران کنژوگه بصورت تجاری موجود است.برای مثال کنژوگه ضد گونه می تواند انتی IgM ، Anti IgG1 ، َAnti IgG2 و به همین ترتیب باشد.سیستم الایزای غیرمستقیم این مزیت را دارد که هر تعداد از انتی سرم ضد یک انتی ژن را می توان با یک کنژوگه ضد گونه بررسی کرد. چنین سیستم هایی به شدت در کاربردهای تشخیصی استفاده میشوند به ویژه هنگامی که ارزیابی (غربالگری) تعداد زیادی از نمونه ها در میان است. مشکلی که وجود دارد این است که در این سیستم ها درجات متفاوتی از اتصال غیر اختصاصی در سرم افراد وجود دارد.این باعث پراکندگی نتایج شده وبرای بررسی میزان اعتماد نیاز به پردازش تعداد زیادی سرم است.

 

2.3 الایزای ساندویچ

الایزای ساندویچ به دو سیستم تقسیم میشود که به الایزای ساندویچ مستقیم و الایزای ساندویچ غیرمستقیم نامگذاری شده اند.

 

2.3.1الایزای ساندویچ مستقیم

الایزای ساندویچ مستقیم در طرح 3 و در شکل 3 نمایش داده شده است.

الایزای ساندویچ مستقیم شامل اتصال غیرفعال انتی بادی ها به فاز جامد (مراحل 1 و 2) است . این انتی بادی ها (انتی بادی های گیرنده ) سپس به انتی ژن (ها) که در مرحله 3 اضافه شده اند متصل میگردند. انتی ژن (ها) در یک بافر مسدود کننده رقیق میشوند تا از اتصال غیر اختصاصی به فاز جامد جلوگیری شود.همینطور اجزای بافر مسدود کننده نباید حاوی انتی ژنهایی باشد که به انتی بادی های گیرنده متصل شوند .بعد از اینکوباسیون و شستشو فکمپلکس انتی بادی انتی ژن به فاز جامد چسبیده است .(مرحله 4).

انتی ژن گرفته شده (گاهی اوقات به نام به دام افتاده نامیده میشود) در ادامه با اضافه کردن و اینکوباسیون انتی بادی های اختصاصی نشاندار شده با انزیم ، که دریک بافر مسدود کننده (مرحله 5) رقیق شده ، تشخیص داده میشوند .بنابراین ، این یک اتصال مستقیم کنژوگه با اهداف انتی ژنی روی انتی ژنهای به دام افتاده است.این انتی بادی دوم می تواند همانند انتی بادیهایی باشد که برای به دام انداختن انتی ژنها به کار گرفته شده اند و یا اینکه از نظر منشا حیوانی یا گونه ای که د رآن تولید میشوند متفاوت باشند.بعد از اینکوباسیون و شستشو (مرحله 6) واکنش انزیم متصل شده، با اضافه کردن سوبسترا/کروموژن (مرحله 7) پیش رفته و سپس با متوقف کردن (مرحله 8) و در نهایت خوانش با یک اسپکتروفتومتر (مرحله 9) به پایان میرسد.

از آنجایی که یک انتی بادی منفرد کنژوگه شده به انزیم استفاده میشود بنابراین ، سیستم محدود به اختصاصیت و ویژگی ها ی ذاتی همان مجموعه انتی بادی ویژه است .این امر یک نوع محدودیت ایجاد میکند ،به این معنی که  هر فراورده انتی بادی استفاده شده باید نشاندار شود (برای انتی ژنهای مختلف) – به همان صورتی که الایزای مستقیم ، محدود به فراورده انتی بادی منفرد است.

از ویژگی های این سیستم این است که  انتی ژنها باید حداقل دارای دو محل انتی ژنی (اپی توپ) باید باشند، چرا که انتی بادی ها ی گیرنده و تشخیص دهنده هر دو باید به انتی ژن متصل شوند.این سبب میشود که سنجش به کمپلکس های انتی ژنی نسبتا بزرگ، محدود باشد.

انتی بادی گیرنده (روی فاز جامد) و انتی بادی تشخیص دهنده ،باید برضد اپی توپهای مختلف روی یک کمپلکس انتی ژنی باشند.این باعث جهت گیری مولکولهای انتی ژنی شده و شانس زیادتری برای اتصال به  انتی بادی های تشخیص دهنده به وجود می اید . با این سیستم الایزا می توان بررسی اختلافاتی کوچک در فراورده های انتی ژنی را با استفاده از انتی بادی های تشخیص دهنده مختلف و یک انتی بادی گیرنده مشترک انجام داد ، کاربریهای بیشتر و به تبع سیستم های متناسب در زیر عنوان 2,3,2 بررسی شده است. استفاده از انتی بادی های دقیقا یکسان هم به عنوان انتی بادی های به دام اندازنده و هم به عنوان تشخیص دهنده ( به عنوان مثال منوکلونال انتی بادی ها ) باعث مشکلاتی میشود که محدود شدن جدی مکانهای موجود، جهت اتصال انتی بادی تشخیص دهنده از ان جمله است. اندازه و ارتباطات فضایی (توپوگرافی) اپی توپها روی هدف انتی ژنی نیز بسیار مهم است و سنجش را تحت تاثیر قرار میدهد.

2,3,2 الایزای ساندویچ غیر مستقیم

الایزای ساندویچ غیر مستقیم در طرح 4 و در شکل 4 نمایش داده شده است.

طرح4.  الایزای ساندویچ غیر مستقیم

 

در الایزای ساندویچ غیر مستقیم مراحل 1 تا 4 شبیه به مراحل الایزای ساندویچ مستقیم است.بنابراین انتی بادی ها به طور غیرفعال به فاز جامد می چسبند و انتی ژن (ها) به دام می افتند . با این حال مرحله 5 شامل اضافه کردن انتی بادی های تشخیص دهنده است.در این مورد انتی بادی های تشخیص دهنده با انزیم نشاندار نیستند .بعد از اینکوباسیون و شستشو (مرحله 6) ،انتی بادی های تشخیص دهنده خود با اضافه شدن و اینکوباسیون با یک کنژوگه انزیمی ضد گونه (مرحله 7) تشخیص داده میشوند.سپس کنژوگه متصل شده همانطور که در دیگر سیستم ها توصیف شد، پردازش میشود(مراحل 8 و 9) .

 

 

مزیت این سنجش این است که هر تعداد از منبع های مختلف انتی بادی ها (نمونه ها ) را می توان به انتی ژن به دام افتاده اضافه کرد، گونه هایی که این آنتی بادی ها در آن تولید میشوند همان گونه های انتی بادی های گیرنده نیستند. به طور اختصاصی، انتی بادی ضد گونه کنژوگه شده با انزیم نباید با انتی بادی های مورد استفاده در به دام اندازی انتی ژن ها واکنش دهد. میتوان از انتی بادی هایی با گونه یکسان استفاده کرد به این شرط که تکنیکهای ایمونوشیمی در انتخاب و تولید اشکال ویژه انتی بادی ها ، با توجه به اختصاصیت کنژوگه انزیمی بکار رفته ، استفاده شود. به عنوان مثال انتی بادی گیرنده را می توان به یک مولکول دو ظرفیتی بدون بخش Fc (نیز موسوم به بخش F(ab)2) پردازش کرد.انتی بادی های تشخیص دهنده می تواند دست نخورده باقی بمانند. کنژوگه انزیمی میتواند یک ضد گونه ضد بخش Fc از مولکول ایمونوگلوبولین باشد.بنابراین کنژوگه تنها با انتی بادی های دارای Fc (و بنابراین نه با مولکولهای گیرنده انتی ژن ) واکنش میدهد. طراحی چنین سنجشهایی به موجود بودن ریاجنت ها وابسته است.

ممکن است یک منوکلونال انتی بادی  اختصاصیت مطلوبی در مقایسه با سرم های پلی کلونال داشته باشد و یا اینکه موردی باشد که بتواند شمار زیادی از منوکلونال انتی بادی های ضد یک انتی ژن به دام افتاده را غربالگری کند(که ممکن است در مقادیر کم یا در مخلوطی از دیگر انتی ژن ها باشد).در این مورد استفاده از سرم های پلی کلونال F(ab)2 نا موفق خواهد بود بنابراین فراورده های قطعه ای انتی بادی های گیرنده با ارزش است و در حقیقت کیت هایی با قابلیت کاربری اسان به این منظور نسبتا موجود هستند .استفاده از انتی بادی های ضد Fc موشی موجود در بازار نیازها را براورده میسازد.

 

2,4 سنجش های رقابتی / مهاری

واژه های رقابت و مهار، سنجش هایی را توصیف میکند که در آن تعیین مقدار یک ماده از طریق توانایی آن در تداخل با یک سیستم از قبل تیتر شده انجام می شود .این سیستم ها تمام پیکربندی های دیگر الایزاها را که قبلا توصیف شد ،دارا می باشند.از این سنجش ها می توان برای اندازه گیری هم انتی بادی و هم انتی ژن استفاده کرد.واژه شناسی استفاده شده در نوشتارها ممکن است کمی سردرگم کننده باشد ، واژه الایزای مسدود کننده به وفور برای توصیف چنین سنجش های استفاده می شده است این بخش کاربردهای ممکن چنین روش شناسی ،که مشخص کننده مزایا ومعایب آن است را توصیف میکند. بطور کلی C-ELISA  (الایزای رقابتی)و I-ELISA( الایزای مهاری) در توصیف سنجشهایی استفاده میشود که شامل عناصر توصیف شده در زیر فهرست 2.1 تا 2.3 بوده و کاربرد ویژه سنجش رقابتی و مهاری بطور خاص برای هر سیستم مختلف نیز بکار گرفته میشود .به توضیحات پیشین در مورد سیستم های پایه شامل الایزای مستقیم ،غیرمستقیم ،و ساندویچ که پایه سنجشهای رقابتی – مهاری است نیز باید رجوع کرد.

2,4,1  الایزای مستقیم رقابتی

ازمایش برای انتی ژن

ازمایش الایزای مستقیم رقابتی برای انتی ژن، درطرح 5 و شکل 5 توصیف و نشان داده شده است.یک سیستم الایزای مستقیم از قبل تیترشده ، با اضافه کردن انتی ژن به چالش کشیده میشود.تاثیر اضافه کردن، با کاهش در رنگ مورد انتظار سیستم از قبل تیتر شده (به عنوان کنترل) اندازه گیری میشود.بنابراین رقابت از مرحله 3 شروع می شود که درآن یک نمونه ، به فاز جامدی که انتی ژن به طور غیر فعال به آن چسبیده، اضافه میشود.این نمونه در یک بافر مسدود کننده رقیق میشود تا از اتصال غیر اختصاصی انتی ژن به فاز جامد جلوگیری شود.در این مرحله هیچ اتصالی نباید اتفاق بیفتد. سپس یک رقت ازقبل تیتر شده انتی بادی نشاندار( اختصاصی برای انتی ژن فاز جامد) اضافه می شود.اکنون رقابت در جایی شروع میشود که انتی ژن مورد ازمایش عرضه شده، یکسان یا شبیه به انتی ژن فاز جامد بوده و قادراست با انتی بادی نشاندار عرضه شده اتصال برقرارکند(مرحله 2a) .میزان رقابت در زمان ، به غلظت نسبی مولکولهای مورد ازمایش و انتی ژن فاز جامد (و به درجه شباهت انتی ژنی ) بستگی دارد.بعد از اینکوباسیون و شستشو ،مقدار انتی بادی های نشاندار در ازمایش ، با اضافه کردن سوبسترا اندازه گیری میشود و به همین ترتیب . وقتی که هیچ انتی ژنی در نمونه مورد ازمایش وجود ندارد و یا وقتی که شباهت انتی ژنی محدود است هیچ اتصالی با انتی بادی های نشاندار رخ نمیدهد(مرحله 2b) ، بنابراین چیزی وجود ندارد تا از اتصال انتی بادی های نشاندارجلوگیری کند ( رقابت کند) (مرحله 3) . نتایج خالص برای نمونه هایی است که حاوی انتی ژن هستند و رقابتی وجود دارد که رنگ مورد انتظار ازقبل تیتر شده را تحت تاثیر قرار می دهد درحالی که د رنمونه های منفی هیچ اثری بر رنگ از قبل تیتر شده وجود ندارد.

 

 

2,4,2  الایزای مستقیم رقابتی

ازمایش برای انتی بادی

ازمایش مستقیم رقابتی برای انتی بادی درطرح 6 و در شکل 6 نمایش داده شده است.سیستم در اینجا با سیستم ازمایش برای انتی ژن یکسان است اما در اینجا اندازه گیری یا مقایسه انتی بادی ها انجام میشود.

 

طرح الایزای مستقیم رقابتی برای ازمایش انتی بادی

 

دوباره در این جا لازم است که سیستم الایزای مستقیم از قبل تیتر شود تا بعد با اضافه کردن انتی بادی های مورد ازمایش ،سیستم به چالش کشیده شود. رقابت دراینجا میان انتی بادی ها ی نمونه مورد ازمایش و انتی بادی ها ی اختصاصی نشاندار شده برای مکانهای انتی ژنی روی انتی ژنهای متصل به فاز جامد است.نمونه مورد ازمایش و انتی بادی های نشاندار تیتر شده ، قبل ازاضافه شدن به پلیت ها ی پوشش داده شده با انتی ژن ، با هم مخلوط میشوند.

2,4,3  

الایزای مستقیم مهاری

ازمایش برای انتی ژن

الایزای مستقیم مهاری برای ازمایش انتی ژن گزینه در دسترسی نیست چرا که انتی ژن مورد ازمایش باید با انتی بادی نشاندار از قبل تیتر شده مخلوط شود .بنابراین سیستم رقابتی استفاده میشود.تغییری که میتوان انجام داد این است که انتی ژن مورد ازمایش را با انتی بادی نشاندارمخلوط نموده و برای مدت زمانی اینکوبه کرد و سپس به پلیت های پوشش داده شده  با انتی ژن اضافه نمود.در عمل این تغییری در سنجش ایجاد نمیکند با وقتی که انتی ژن به پلیتهای کوت شده درهمان ابتدا اضافه شوند.

 

2.4.4

الایزای مستقیم مهاری

ازمایش برای انتی بادی

نمونه مورد ازمایش که احتمالا حاوی انتی بادی های اختصاصی علیه انتی ژن روی پلیت است اضافه شده و برای مدت زمانی اینکوبه میشوند. حال دو گزینه وجود دارد: 1: چاهک ها شستشو داده میشوند و سپس انتی بادی نشاندار از قبل تیتر شده اضافه میشود و یا 2: انتی بادی نشاندار از قبل تیتر شده را می توان به چاهک ها اضافه کرد درحالی که حاوی نمونه مورد ازمایش است . در این دو روش مزیت متصل شدن به انتی ژن روی چاهک ها به نمونه مورد  ازمایش داده میشود. انتی بادی های اتصال یافته ، اتصال انتی بادی های نشاندار بعدا اضافه شده را مهار میکند.

2.5

سنجش های رقابتی و مهاری برای الایزای غیر مستقیم

2.5.1

الایزای غیر مستقیم رقابتی برای اندازه گیری انتی ژن

اندازه گیری انتی ژن به روش الایزای غیر مستقیم رقابتی در طرح 7 و در شکل 7 نمایش داده شده است.

 

2.5.2

اندازه گیری انتی بادی به روش الایزای غیر مستقیم رقابتی

اندازه گیری انتی بادی به روش الایزای غیر مستقیم رقابتی در طرح 8 و شکل 8 نشان داده شده است.

 

توجه داشته باشید که ازهمان سیستم تیتر شده می توان برای تیتراسیون هم انتی ژن و هم انتی بادی استفاده کرد.حساسیت انالایتیکال سیستم را همانطوری که برای اندازه گیری انتی ژن و انتی بادی تنظیم شده می توان با تغییر تیتراسیون ابتدایی ریاجنتها در مرحله تیتراسیون ابتدایی تغییر داد.بنابراین با استفاده از غلظتهای مختلف انتی بادی ،حساسیت موثربرای برقراری رقابت یا مهار با انتی ژن یا انتی بادی را می توان به  نفع حساسیت انالیتیکال یا اختصاصیت انالیتیکال سوق داد.مهم است که این مساله به هنگام طراحی سنجش های رقابتی یا مهاری برای اندازه  گیری انتی ژن یا انتی بادی  ،درک شود.تغییرغلظتهای واکنشگرها می تواند تستهای بسیار ایده الی را ارایه دهد تا به پارامترهای انالیتیکال مورد نیاز رسید(سطح های مورد نیاز از اختصاصیت و حساسیت).این مساله به ویژه در هنگام طراحی سنجش هایی برپایه استفاده از انتی بادی های پلی کلونال مهم است  چرا که از رقتهای مختلف سرم ها بسیارتاثیر می پذیرد(تغییر در کیفیت سرم با تغییر در غلظتهای نسبی انتی بادی های ضد نواحی انتی ژنی اختصاصی).

 

2.5.3 :

 اندازه گیری انتی ژن با الایزای غیرمستقیم مهاری

نمونه مورد ازمایش که حاوی انتی ژن است را می توان با انتی بادی ازقبل تیتر شده مخلوط کرد و اینکوبه نمود.سپس این مخلوط به پلیت های پوشش داده شده با انتی ژن اضافه میگردد. بنابراین مزیت اتصال به انتی بادی به نفع نمونه مورد ازمایش است.این روش در طرح 9 نشان داده شده است.

 

2.5.4

اندازه گیری انتی بادی با الایزای غیر مستقیم مهاری

اصول اندازه گیری انتی بادی با الایزای غیر مستقیم مهاری همانطور که در ادامه به صورت طرح نشان داده شده است.نمونه حاوی AB به پلیت های پوشش داده شده با انتی ژن اضافه شده و اینکوبه میگردد.انگاه دو گزینه وجود دارد 1: یک مرحله شستشو و بدنبال آن  اضافه کردن انتی بادی از قبل تیتر شده و یا 2: مرحله شستشو انجام نمیشود و انتی بادی از قبل تیتر شده به مخلوط اضافه میگردد.این در طرح 10 نمایش داده شده است.دوباره در اینجا مزیت اتصال به نفع نمونه است.

 

2.6

سنجشهای رقابتی و مهاری در الایزای ساندویچ

با مراجعه به بخش های قبلی به یاد می اوریم که الایزای ساندویچ باسیستم های مستقیم و غیر مستقیم قابل انجام است که در هر دو از انتی بادی نامتحرک شده روی فاز جامد استفاده میشود تا انتی ژن را به دام بیندازد.در الایزای ساندویچ مستقیم انتی بادی تشخیص دهنده ،با انزیم نشاندار شده است ،درحالی که در سیستم غیر مستقیم انتی بادی تشخیص دهنده نشاندار نیست و در عوض با استفاده از یک کنژوگه ضد گونه تشخیص داده میشود.

هر دو سیستم از آنچه که در قبل توصیف شده اند بعلت وجود مراحل بیشتر،پیچیده تر هستند . و به دنبال آن، گزینه ها جهت  تغییر در مراحل رقابت یا مهار نیز بیشتر است.به این نکته باید توجه کرد که چرا یک سیستم معین در مقایسه با دیگر سیستم ها مورد استفاده قرار میگیرد.

طرح 9. الایزای غیر مستقیم مهاری برای اندازه گیری انتی ژن

نکته مهم در استفاده از سنجش های ساندویچ این است که در عرضه انتی ژن ها ضروری بحساب می ایند معمولا این عمل با تغلیظ انتی ژن خاص از یک مخلوط انتی ژنی با استفاده از سرم به دام اندازنده مخصوص انجام می شود.بنابراین مزیت های تکنیکهای رقابتی /مهاری متکی بر به دام انداختن انتی ژن است .اینکه روش مستقیم یا غیر مستقیم اندازه گیری انتی بادی تشخیص دهنده انجام شود، دقیقا به نوع سنجش استفاده شده دارد.این بخش اصول مربوط را در بر میگیرد و در عوض مشکلاتی را هم که باید مورد توجه قرار گیرد، برجسته میکند .سیستم های نامناسب نیز مثال زده میشوند.

سنجش ها تحت عناوین ساندویچ مستقیم و ساندویچ غیر مستقیم توصیف میشوند. ساندویچ مستقیم شامل سنجش هایی هستندکه از یک انتی بادی گیرنده و از یک انتی بادی تشخیص دهنده نشاندار (سیستم های دو انتی بادی) استفاده میکند و ساندویچ غیر مستقیم شامل سنجش هایی هستند که از سیستم های سه انتی بادی استفاده میکنند ( کنژوگه ضد گونه جهت اندازه گیری سرم تشخیص دهنده بکار میرود).

 

 

 تشخیص انتی ژن یا انتی بادی توسط این سنجش ها توضیح داده خواهد شد همانند بخش های قبلی.کاربرد سنجش های رقابتی (C) و مهاری (I) نیز توصیف خواهند شد.همیشه به باز بینی سیستم پایه توجه داشته باشید چون لازم است هر کدام به منظور مناسب سازی شرایط ، قبل از استفاده در سنجش رقابتی /مهاری تیتر شود.

 

 

2.6.1

الایزای ساندویچ مستقیم رقابتی برای اندازه گیری انتی بادی در طرح 11 و شکل 9 نشان داده شده است.

 

2.6.2

الایزای ساندویچ مستقیم مهاری برای اندازه گیری انتی بادی

الایزای ساندویچ مستقیم مهاری برا ی اندازه گیری انتی بادی همانی است که در سیستم نوع رقابتی مذکور توصیف شد بجز اینکه نمونه مورد ازمایش ، مدتی قبل از اضافه شدن انتی بادی نشاندار به انتی ژن به دام افتاده اضافه می شود.به دنبال این مرحله اینکوباسیون دو گزینه وجود خواهد داشت.

 

اول اینکه انتی بادی های نشاندار تیتر شده را مستقیما به مخلوط واکنش اضافه کنیم و بدنبال آن یک اینکوباسیون صورت گیرد.راه دوم این است چاهک ها را شستشو دهیم به این وسیله هر گونه انتی بادی مورد ازمایش اضافی را قبل از اضافه کردن انتی بادی های نشاندار می شوییم.برای هر یک از گزینه ها یک مرحله اینکوباسیون برای انتی بادی نشاندار وجود دارد که با شستشو و سپس اضافه کردن محلول سوبسترا /کروموژن دنبال میگردد.نتایج درتناسب با کاهش رنگ بوده و در مقایسه با کنترل هایی که فاقد نمونه مورد ازمایش هستند، خوانده میشود.هرچه غلظت انتی بادی های مورد ازمایش اتصالی بیشتر باشد در نتیجه ،درجه مهار شدن انتی بادی های نشاندار بیشتر خواهد بود.

درالایزای ساندویچ غیر مستقیم تعداد اجزا افزایش میابد و متعاقبا تعداد ترکیبات ریاجنت ها نیز افزایش خواهد یافت .خواننده باید تا کنون به نحوه توصیف به صورت طرح کاملا اشنا شده باشد تا اینکه مجموعه دیگراز سنجش هایی که از الایزای ساندوچ غیرمستقیم بهره میگیرد واصولی که در آن برجسته است ،مختصرتر بررسی شود.

الایزای ساندویچ مستقیم رقابتی برای اندازه گیری انتی بادی .دراین سیستم انتی بادی های یک نمونه ، با یک مقدار از قبل تیتر شده انتی بادی نشاندار اختصاصی به انتی ژن ، بر سر اتصال به انتی ژن به دام افتاده توسط انتی بادی های پوشش دهنده چاهک ها ، رقابت میکند.میزان رقابت بستگی به غلظت نسبی انتی بادی های نمونه و نشاندار دارد.

 

2.6.3

الایزای ساندویچ مستقیم رقابتی و مهاری برای انتی ژن

الایزای ساندویچ مستقیم رقابتی و مهاری برای انتی ژن ،برای ارزیابی انتی ژنی که در نمونه مورد ازمایش وجود دارد مناسب نیست .

2.6.4

 الایزای ساندیچ غیر مستقیم رقابتی برای انتی بادی

خواننده لازم است اجزای الایزای ساندویچ غیر مستقیم را دوباره بررسی کند.دراینجا همانند سیستم الایزای ساندویچ مستقیم، انتی ژن با انتی بادی های چسبیده به چاهک به دام می افتد.در اینجا تفاوت این است که انتی ژن ابتدا با یک انتی بادی غیر نشاندار شناسایی میشود و سپس در عوض با یک کنژوگه ضد گونه، شناسایی و تعیین مقدار میگردد. زمان دقیقی که در آن ریاجنتها /نمونه ها اضافه میشوند تعیین میکند که ایا سیستم رقابت را بررسی میکند یا مهار را ؟.طرح 12 جایی را نشان میدهد که نمونه اضافه میشود تا با سیستم ساندویچ غیر مستقیم تیترشده رقابت کند.

نکته مهم این است که کنژوگه انزیم انتی بادی (AB) با انتی بادی ها ی موجود در نمونه مورد  ازمایش نباید اتصال برقرار کند.درجه رقابت متناسب با مقدار انتی بادی های موجود در نمونه مورد ازمایش است .

این سیستم  انعطاف زیادی در استفاده ازانتی بادی های تشخیص دهنده گوناگون (AB) برای انتی ژن به دام افتاده ، در مقایسه با سنجش ساندویچ مستقیم دارد.این سیستم تولید کنژوگه های خاص ضد هر یک از سرم ها به عنوان انتی بادی های (AB)تشخیص دهنده را برطرف می سازد.اساسا این سیستم به نفع یک واکنش خالص است چرا که اتصال مولکولهای انزیم مستقیما به انتی بادی ها می تواند افینیتی آنها را تحت تاثیر قرار دهد (و به این ترتیب اویدیتی انتی بادی تشخیص دهنده AB را نیز هم ).بنابراین چنین سیستمی در مواقعی ایده ال است که انتی ژن باید به دام افتد و نیز درمواردی که تعدادی از سرم های تشخیص دهنده باید بدون اصلاحات شیمیایی و فیزیکی مورد تحلیل قرار گیرند.این نیز در سیستم های الایزا که درادامه توصیف میشوند بکار گرفته میشود.

 

2.6.5

الایزای ساندویچ غیر مستقیم مهاری برای انتی بادی

الایزای ساندویچ غیر مستقیم مهاری برای اندازه گیری انتی بادی شبیه به الایزای رقابتی است بجز اینکه زمان اضافه کردن ریاجنتها تغییر می یابد تا شانس بیشتری برای واکنش داده شود .این سیستم در طرح 13 نشان داده شده است.

 

2.6.6

الایزای ساندویچ غیرمستقیم رقابتی برای اندازه گیری انتی ژن

مشکل اصلی در این نوع از سنجش انتی ژن (الایزای ساندویچ غیر مستقیم مهاری) این است که چاهکها با انتی بادی های که انتی ژن را به دام می اندازند پوشانده میشوند.

اگر در ابتدا با انتی ژن کوت کننده کاملا اشباع نشده باشند هر گونه اضافه کردن بعدی انتی ژن بصورت انتی ژن موجود در نمونه سبب خواهد شد که به چاهک ها متصل شوند.در این مرحله سیستم تیترشده نباید هیچگونه انتی بادی ازادی که  چاهک ها را بپوشاند داشته باشد.به این ترتیب وضعیت دقیق پیش تیتراسیون ممکن است متفاوت از وضعیتهای سنجش انتی بادی که در زیر عنوان 2.6.4 و 2.6.5 بررسی شد ،باشد. انتی ژن لازم است که بصورت مازاد باشد همانطور که در طرح 14 نیز نشان داده شده است.

فاز رقابت بین نمونه مورد ازمایش که احتمالا حاوی انتی ژن است و انتی بادی ثانویه تشخیص دهنده (AB) اتفاق می افتد که در طرح 15 نشان داده شده است.

 

2.6.7

الایزای ساندویچ غیر مستقیم مهاری برای انتی ژن

الایزای ساندویچ غیر مستقیم مهاری برای انتی ژن اساسا با الایزای رقابتی یکسان است بجز اینکه AB و انتی ژن نمونه بطور جداگانه مخلوط و اینکوبه میگردند پیش از اینکه به چاهکهای حاوی انتی ژن به دام افتاده اضافه شوند.

 

2.7

انتخاب سنجش ها

پرسش سختی است که هنگام استفاده از الایزا کدام سیستم مناسبتر است ؟ این بخش به ارتباط بین سیستم های مختلف برای ارزیابی مناسب ترین سیستم ها می پردازد.پرسشهای زیر باید مورد توجه قرار گیرند.

1. هدف از سنجش چیست ؟
2. چه ریاجنتهایی دارم؟
3. چه چیزهایی درباره ریاجنتها میدانم؟
4. ایا سنجشی که قرار است برای منظور تحقیقاتی طراحی شود ، قرار است تنها توسط من استفاده گردد یا قرار است توسط کاربران دیگرنیز استفاده شود؟
5. ایا  قرار است این سنجش در ازمایشگاههای دیگر نیز استفاده شود؟
6. ایا کیت لازم است ؟

این سوالها تاثیری مستقیم بر قوانین عموی در طراحی سنجش ها دارد .برای مثال

1. توجیه و امکان سنجی – اثبات میشود که سیستم میتواند کار کند(فاز1).
2. اعتبارسنجی - نشان میدهد که تست(ها) پایدار هستند و در گذر زمان و تحت شرایط مختلف مورد ارزیابی قرار گرفته اند (فاز 2).
3. استاندارد سازی - کنترل کیفی ، که بناگذاری آن نشانه دقیق بودن سنجش بوده و توسط کاربران دیگر در ازمایشگاههای مختلف قابل استفاده است.در این مرحله یک بررسی کلی از موجود بودن ریاجنتها انجام میشود و نیز اثری که موجود بودن ریاجنتها در طراحی  سیستم های متعدد دیگر دارد بررسی میشود.(فاز 3).

 

2.7.1

بررسی نیازها

فرض بر این است که در زمینه مورد مطالعه علاقه مندیهایی در استفاده از الایزا وجود دارد.پس اینطور میتوان نتیجه گرفت که یک درکی از مشکل ، در قالب مفاهیم بیولوژی و نیز تایید نوشتارهایی در رابطه با انتی ژنهای هدف و برهم کنش های احتمالی هر یک از عوامل با حیوانات وجود دارد.اگر چنین دانشی وجود ندارد باید از طریق تماس با محققین دیگر و نیز با خواندن نوشتارهایی در این زمینه وموضوعات مرتبط به  شمول بررسی سنجش های طراحی شده قبلی ( شامل هر نوع الایزا ) جستجو شود. متاسفانه به وضوح ،اطلاعاتی که درطراحی سریعتر سنجش های جدید و ارزیابی مقایسه ای داده ها خیلی راحت در دسترس هستند، اغلب نادیده گرفته میشوند.

برای مثال

1.  ممکن است یک انتی ژن داشته باشیم و ممکن است در مورد آن خیلی بدانیم و یا خیلی کم بدانیم
2. ممکن است یک پروتیین /پلی پپتید/پپتید با غلظت زیاد و با توالی امینواسید معلوم داشته باشیم و یا یک سوپ غلیظ از پروتیین های مخلوط که حاوی انتی ژن(ها) در یک غلظت پایین بوده و  آلوده به پروتیین های سلول میزبان باشد.
3. ممکن است یک انتی سرم علیه انتی ژن داشته باشیم ، که ممکن است ضد انتی ژن خالص و یا ضد یک سوپ غلیظ پروتیینی باشد.انتی بادی ممکن است در یک گونه خاص مانند خرگوش تولید شده باشد .ممکن است یک جزئ IgG از انتی سرم را داشته باشیم (یا بتوانیم آنرا ایجاد کنیم).
4. ممکن است سرم های میدانی ضد انتی ژن داشته باشیم (سرم های گاوی).ممکن است یک منوکلونال انتی بادی داشته باشیم.ممکن است انتی سرم از گونه های مختلف داشته باشیم مانند خرگوش و سرم های خوکچه هندی . برای سیستم های مشابه ممکن است الایزا طراحی شده و در نوشتارها وجود داشته باشد.
5. ممکن است به یک واکنش انزیمی در سنجش نیاز داشته باشیم و بنابراین یک کنژوگه ضد گونه (احتمالا بصورت تجاری)نیاز خواهیم داشت یا مجبور خواهیم بود که سرم مختص به  انتی ژن را نشاندار (که البته باید توجه داشته باشیم که تسهیلات انجام آن فراهم است یا خیر؟) کنیم.ما باید تصمیم بگیریم که کدام کنژوگه تجاری را خریداری کنیم.این بستگی به اختصاصیت مورد انتظار از کنژوگه دارد (ضد مولکول کامل IgG،ضد زنجیره سنگین IgG،ضد زنجیره سنگین IgM، و به همین ترتیب).انتخابها تاحدی بوسیله اهداف سنجش و طراحی آن صورت میگیرد.بنابراین ممکن است دوست داشته باشیم که پاسخ IgM گاوی را به انتی ژن مان تعیین کنیم که در نتیجه به یک ضد IgM اختصاصی در پروتوکل الایزا در یک مرحله ای نیاز خواهیم داشت.

واضح است که نیازهای پایه برای انجام الایزا مانند پلیتها ،پیپتها ،بافرها،خوانشگر و غیره در نظر گرفته شود.بعلاوه اگر نیاز به طراحی مجموعه ای از ریاجنتها است که قراراست به عنوان یک سنجش جهانی استفاده شوند، ارزیابی هرچه سریعتر نیازها لازم است.بنابراین در رابطه با میزان احتمال استفاده از سنجش و واحدهای ازمایش در مدت زمانی معین ، باید براوردی صورت گیرد.این براوردها به شکل حجم انتی ژن ،انتی سرم و کنژوگه (پلیت ها ،نوک های پیپت ،و غیره ) قابل تعریف است.میزان این نیازرا از روی آنچه که طراحی شده میتوان مقایسه کرد(ویا اینکه چه نیازهایی باید در نظر گرفته شود).

برای مثال سنجشی که طراحی میشود ممکن است وابسته به یک انتی سرم خرگوشی منفرد باشد.حجم نهایی ممکن است 30 میلی لیتر باشد .تیتر مورد استفاده در سنجش ممکن است 1000/1 باشد.حجم تست مورد استفاده 50 میکرولیتر است .بنابراین بیشینه تعداد نمونه ها که بتوان بصورت تست های منفرد انجام داد به این صورت است که 30*1000*20 =600000

این برای مصرف جهانی برای 10 ازمایشگاه (60000 نمونه در سال) برای یک سال یااگر ازمایشها 6000 نمونه در سال انجام شود ،این ریاجنتها برای 10 سال کافی خواهد بود.با این حال اگر تیتر سرم خرگوشی 100/1 باشد این ریاجنت تنها برای ازمایش  60000 نمونه کافی است که ممکن است برای ازمایش در سطح جهانی خیلی کم باشد.

اگرچه این یک شیوه ساده شده ای است اما درک بهنگام اینکه چرا الایزایی که طراحی میشود ضروری است ،اغلب تا زمان بررسی نیازها در سطح جهانی مورد غفلت واقع میشود.این شیوه نیز باید با ملاحظات تولید انتی ژن همراه باشد،به ویژه وقتی که تولید آن بسیار سخت است. چنین ملاحظه هایی ،انتخاب سیستم های خاص استفاده شده را میتواند اصلاح کند.بنابراین اگرچه یک الایزای غیر مستقیم موفق که از انتی ژن خالص استفاده میکند ممکن است طراحی شود، با اینحال ممکن است تولید انتی ژن پایین باشد و پردازش آن پرزحمت و گران چنانکه هر گونه بهره برداری از سنجش در مقیاس بزرگف غیرممکن به نظر برسد. ممکن است با استفاده از انتی بادی های گیرنده و فراورده های انتی ژن ناخالص (که به راحتی قابل تهیه هستند) در طراحی سنجش های ساندویچ از شدت آن کاست.

این شیوه در مورد کنژوگه ها نیز صدق میکند که بصورت محصولات تجاری معین و یا ریاجنتهای تولید شده بصورت محلی وجود دارند وموفقیت الایزا را تضمین می کنند. از دوام تامین و استانداردسازی ریاجنتها ،و اینکه این مقادیرباید برای رفع نیازهای طولانی مدت کافی باشد باید اطمینان حاصل شود.

 

2.7.2

ارزیابی سنجش های ممکن با مواد موجود

همانطور که قبلا بیان شد ، باید اول ریاجنتهای موجود ارزیابی شوند.این بخش به بررسی بعضی از حدود و وضعیتها میپردازد تا ارتباط سنجشهای ممکن و مزیتهای ویژه آنها را نشان دهد.در اینجا سناریو هایی توصیف میشود (A – C) که ریاجنتهای مختلفی در ان موجود است و احتمالا بیشتر مواردی را که قبلا در عمل بررسی شده اند پوشش خواهد داد. در نظر بگیریم که سرم هایی از حیوانات عفونی شده وغیرعفونی شده برای ازمایش وجود دارد.ظرافتهای دیگر رامی توان در تعریف اختصاصیت کنژوگه ها (anti-IgG ، IgM ،و یا اینکه آنها مختص زنجیره سنگین هستند ) بررسی کرد.افزایش در انتخاب ریاجنتها و گزینه های مختلف در پیکربندی های مختلف الایزا در ادامه اورده میشود.

1.  

سناریوی A

1. انتی ژن ناخالص (دارای چندین مکان انتی ژنی)
2. انتی بادی تولید شده در خرگوش ضد انتی ژن ناخالص
3. کنژوگه ضد گاوی
4. سرم های گاوی قبل از عفونت و پس از عفونت

2.

سناریو B

1. انتی ژن خالص (به مقدار کم، مثلا 100 میکروگرم)
2. انتی ژن ناخالص(مقدار زیاد)
3. انتی بادی ایجاد شده در خرگوش علیه انتی ژن خالص
4. کنژوگه ضد خرگوش
5. کنژوگه ضد گاوی
6. سرم های گاوی غیرعفونی و عفونی

3 .  

سناریو C

a . انتی ژن ناخالص (همانند A)

b. انتی بادی ضد انتی ژن خالص (خرگوش)

c. انتی بادی ضد انتی ژن خالص ( خوکچه هندی)

d. کنژوگه ضد خوکچه هندی

e. سرم گاوی قبل و پس از عفونت

f. کنژوگه ضد گاوی

g. کنژوگه ضد خرگوش

 

سناریو A

استفاده از انتی ژن ناخالص بطور مستقیم در الایزا ممکن است موفقیتی ایجاد نکند چرا که آنتی ژن ناخالص نسبت به سایر پروتیین ها در غلظتهای پایین حضور داشته و بنابراین با غلظت پایین میچسبد.بنابراین باعث عدم امکان استفاده از شیوه های الایزایی می شود که در زیر عناوین 2.1 و 2.2 و شیوه های رقابتی که در زیر عناوین 2.4 و 2.5 بیان شده ، میشود.

از آنجایی که سرم خرگوشی ضد آنتی ژن موجود است میتوان از آن به عنوان سرم گیرنده استفاده کرد ( یا به عنوان IgG گیرنده) و در چاهک ها پوشش داد تا انتی ژن ناخالص را به دام انداخت و غلظتهای بیشتری را برای اتصال فراهم ساخت.بنابراین سیستم های مطرح در زیر عناوین 2.3 و 2.6 قابل استفاده خواهند شد.

بنابراین هر گونه انتی بادی گاوی متصل شده  تحت ازمایش، با استفاده از یک کنژوگه ضد گاوی تشخیص داده خواهد شد.این ممکن است سبب بروز مشکلاتی شود چون انتی ژن ناخالص برای ایجاد سرم خرگوشی استفاده شده است .به این ترتیب ممکن است انتی بادی هایی ضد پروتیین های الوده کننده (پروتیین های ایجاد کننده ناخالصی)، درخرگوش ایجاد شده باشد.سرم های گاوی مورد ازمایش ممکن است با این الوده کننده های به دام افتاده واکنش دهند.با این حال وقتی که انتی ژن، یک عامل عفونی باشد انتی بادی های ضد پروتیین های الوده کننده ممکن است ایجاد نشده وبه این ترتیب مشکل حذف شود.

هنگامی که انتی ژن بصورت یک واکسن استفاده شود که در آن فراورده های ناخالص شبیه به انتی ژن ناخالص بطور نسبی در فرمولاسیون واکسن استفاده شده است بنابراین مشکل همچنان وجود خواهد داشت.فرایندهایی را می توان برای تولید سرم خرگوشی اختصاصی ضد هدف انتی ژنی مورد نظر بکار برد.

از ایمونوزوربنت های فاز جامد شامل عناصر ناخالص الوده کننده ( بجز انتی ژن مد نظر) می توان استفاده کرد تا انتی بادی های ضد ناخالصی ها از سرم خرگوش حذف شود که در غیر آن صورت به عنوان سرم گیرنده تیتر میشدند.به عنوان مثال می توان از تیتراسیون انتی بادی های ویروس بیماری پا و دهان  نام برد.این ویروس در کشت بافت حاوی سرم گاوی رشد می کند.حتی اگر ویروس از چنین فراورده ای تخلیص شود مقادیر کمی از سرم گاوی ،ویروس را الوده خواهند کرد.هنگامی که این ویروس تخلیص شده به حیوانات ازمایشگاهی به صورت فراورده غیرفعال شده تزریق شود مقدار زیادی انتی بادی ضد گاوی علاوه بر اتی بادی های ضد ویروسی تولید خواهد شد.این سرم رانمی توان در سیستم گیرنده برای تشخیص اختصاصی ویروس رشد یافته درنمونه کشت بافت (حاوی سرم گاوی) استفاده کرد چرا که سرم گاوی را هم به دام می اندازد.سرم گیرنده برای به دام انداختن ویروس نسبتا خالص برای تیتراسیون انتی بادی های گاوی در نمونه های سرم گاوی مناسب نیست چرا که این انتی بادی های گیرنده به شکلی قوی با سرم گاوی تشخیص دهنده، واکنش میدهند.بنابراین سرم گیرنده باید با ایمونوزوربنتهای فاز جامد تولید شده از طریق چسباندن سرم گاوی به دانه های اگاروز،  جذب شده و تصفیه شود.

وقتی که اختصاصیت سرم گیرنده مشخص شد ،مناسب سازی غلظت انتی ژن ناخالص با استفاده از یک یا چند سرم گاوی مثبت معلوم در طیف کاملی از رقت ها باید انجام شود.طیف رقت از سرم های منفی ، بررسی تفاوت بین سرم های منفی و مثبت را در رقت های مختلف سرمی میسر میکند.طرح زیر استفاده از ریاجنت ها را برای طراحی یک الایزای ساندویچ نشان میدهد.این سنجش از طریق به دام انداختن اختصاصی مقادیر کافی انتی ژن بوسیله سرم خرگوشی فاز جامد امکان پذیر است.

سناریو B

این سناریو چندان از سناریو A متفاوت نیست ، با این حال ریاجنتهای زیادتری وجود دارد.انتی ژن خالص برای ایجاد انتی بادی در خرگوش موجود است.بنابراین همانند سناریو A پایه هایی برای الایزای ساندویچ وجود دارد چون انتی بادی های خرگوشی، انتی ژن را با غلظت بالا نسبت به فراورده انتی ژنی ناخالص به دام می اندازد به این علت که غلظت آن زیاد است .سیستم طراحی الایزای ساندویچ همانطور است که دربالا نشان داده شده است.

اگر انتی ژن اختصاصی به قدر کافی به پلیت ها متصل شود، موجود بودن کنژوگه ضد خرگوشی طراحی سنجش رقابتی را مقدور میکند ،البته همانطور که پیشتر مشخص شد نامحتمل به نظر میرسد.سرم خرگوشی و انتی ژن در یک الایزای غیر مستقیم (زیرعنوان 2.2 را ببینید)در یک مدل صفحه شطرنجی تیتر شده و مناسب سازی انتی ژن و سرم انجام میشود.ازاین رقت های مناسب شده د ر طراحی الایزای رقابتی (زیر عنوان 2.5.2 را ببینید) می توان استفاده کرد به شکلی که  در آن سرم های گاوی با سیستم انتی ژن /خرگوشی /کنژوگه ضد خرگوشی از پیش تیتر شده به رقابت می پردازد.دوباره باید تاکید شود از آنجایی که انتی ژن ناخالص است و بعضی از سیستم های مبتنی بر به دام انداختن نیازمند به دام افتادن مقادیر کافی از انتی ژن در سطح چاهک ها هستند این طراحی ناممکن به نظر میرسد.

از آنجایی که سناریو B مقداری انتی ژن خالص دارد می توان از آن در طراحی سنجش رقابتی مشابه استفاده کرد.طراحی این سنجش به موجود بودن انتی ژن بستگی دارد که میزان موجودی را می توان بعد از تیتراسیون ابتدایی با مدل صفحه شطرنجی که در آن رقت مناسب انتی ژن بدست میاید تعیین کرد.عمده مزیت بدست اوردن انتی ژن خالص این است که سرم بسیار اختصاصی را از خرگوش ها بدست اوریم تا به دام انداختن اختصاصی انتی ژن در نمونه ناخالص فراهم شود.در بسیاری از موارد انتی ژن کافی با درجه خلوص مطلوب برای استفاده در سنجش ها وجود دارد.

 

سناریو C

در اینجا تمام گزینه های دو وضعیت اول به اضافه تولید سرم از گونه دوم (خوکچه هندی) بر ضد انتی ژن خالص شده وجود دارد.

این اجازه طراحی سنجش های ساندویچ رقابتی (زیرعنوان 2.6 را ببینید )را با استفاده از سرم های خرگوش یا خوکچه هندی به عنوان سرم گیرنده و یا تشخیص دهنده در رقابت با کنژوگه ضد گونه مربوط میسر میسازد.

گونه های مختلف ممکن است خصوصیات بهتری در عملکرد به عنوان ریاجنتهای گیرنده داشته باشند و نیز اختصاصیت متفاوتی را نشان بدهند .این بررسی در تیتراسیون مدل صفحه شطرنجی قابل ارزیابی است و ما به نتایج تشخیص و تیتراسیون سرم های گاوی نیاز داریم چون فاز رقابتی متکی به گسسته شدن انتی بادی از پیش تیتر شده، درجایی نزدیک به  نقطه واکنش سرم گاوی با انتی ژن است.سرم خرگوش یا خوکچه هندی ممکن است در مقایسه با سرم های گاوی از نظر اختصاصیت متفاوت باشند.

 

نکات بیشتر

سنجش نشان داده شده در زیر عنوان 2.4.2 (الایزای مستقیم رقابتی ) احتمالا بخاطر وجود انتی ژن ناخالص مناسب نیست (به دلایل پیشتر گفته شده ).با این حال اگر نشان داده شود که انتی ژن کافی می تواند بچسبد و سرم گاوی بطور اختصاصی واکنش میدهد (و نه از طریق انتی بادی های مازاد نشانه رفته  علیه ناخالصی ها در انتی ژن) آنگاه ما می توانیم سنجش هایی را بر مبنای این سیستم طراحی کنیم.این کارنیاز به  شناسایی یک سرم گاوی مثبت و نشاندار کردن این سرم با یک انزیم دارد.

از موارد ارزشمند عملی این است که بتوان از سرم گاوی مثبت نشاندار شده با انزیم استفاده کرد.آنگاه از این سرم می توان هم به عنوان گیرنده به ویژه بخش IgG آن و هم برای تشخیص استفاده کرد.با این روش سنجش رقابتی نشان داده شده در زیر عنوان 2.6.1 عملی بوده ودارای این مزیت است که واکنشی که علیه آن ،رقابت صورت میگیرد به نوعی همسان هستند (انتی بادی گاوی علیه انتی ژن). با این کار از پیچیدگی های استفاده از انتی سرم گونه دوم تولید شده به روش واکسیناسیون پیشگیری میشود.این سیستم برای اندازه گیری رقابت به وسیله دیگر سرم های گاوی مناسب است چون انتی بادی تشخیص دهنده نشاندار شده اند.بنابراین یک محقق با در اختیار داشتن ریاجنت های نسبتا کم و توانایی نشاندارکردن انتی بادی ها با یک انزیم ممکن است مواد کافی برای طراحی سنجش ها داشته باشد.این توصیف ها در مورد گزینه های یک سیستم ، روی تشخیص انتی بادی تمرکز یافته است.توجه داشته باشید که بیشتر این نکات مربوط به تشخیص انتی ژن است.