انزیم و انالیز سرعت (Enzyme and rate analyses) - بخش دوم

انزیم و انالیز سرعت (Enzyme and rate analyses) - بخش دوم

 

 

کوانزیم ها و گروه های پروستتیک (coenzymes and prosthetic groups)

 

کوانزیم ها معمولا مولکولهای پیچیده تری نسبت به فعال کننده ها هستند اگر چه نسبت به مولکول انزیم کوچکتر هستند.برخی ترکیبات مانند دی نوکلئوتیدها NAD و NADP به عنوان کوانزیم ها طبقه بندی میشوند و سوبستراهای اختصاصی در واکنشهای دو سوبسترایی هستند.اثرهای آنها بر سرعت واکنش از الگوی میکائیلیس – منتن با وابستگی به غلظت سوبسترا پیروی میکند.ساختار این دو کوانزیم یکسان است جز اینکه یک گروه فسفات اضافی در NADP وجود دارد با این وجود دهیدروژناز های منفردی که این کوانزیم ها برای آنها سوبسترا هستند بیشتر و یا حتی بطور مطلق اختصاصی برای یکی یا شکل دیگر کوانزیم می باشند.

کوانزیم هایی مانند NAD و NADP تنها بطور لحظه ای به انزیم طی واکنش متصل میشوند همانند سوبسترا ها.بنابراین هیچ واکنشی رخ نمیدهد مگر اینکه کوانزیم کافی در محلول وجود داشته باشد ( برای نمونه با افزودن این کوانزیم ها به مخلوط واکنش برای سنجش فعالیت دهیدروژناز ).برخلاف این کوانزیم های کاملا محلول برخی کوانزیم ها کم و بیش بطور همیشگی به مولکول های انزیم وصل میشوند و بخشی از جایگاه فعال انزیم را شکل میدهند و دوره هایی از تغییرهای شیمیایی را طی واکنش به خود می بینند.هنگامی که کوانزیم ها متصل باشند به عنوان گروه پروستتیک(prosthetic group) خوانده میشوند.

هولوانزیم (holoenzyme) فعال از ترکیب اپوانزیم (apoenzyme) غیر فعال با گروه پروستتیک به دست میاید.یک نمونه از گروه پروستتیک پیریدوکسال 5- فسفات (pyridoxal-5-phosphate) است که جزیی از انزیم های AST و ALT است.گروه پروستتیک پیریدوکسال فسفات یک چرخه ای از تبدیل دنباله پیریدوکسال به پیریدوکسامین (pyridoxamine) را به خود میبیند و دوباره با انتقال یک گروه امینو از یک امینو اسید به یک اکسو-اسید تبدیل میشود.گروه های پروستتیک مانند فعال کننده ها با نقش ساختاری معمولا لازم نیست برای برانگیختن فعالیت کامل کاتالیزی انزیم افزوده شوند مگر اینکه تیمارهای پیشین سبب شده که گروه های پروستتیک از برخی مولکولهای انزیم حذف شده باشد.با این حال هم نمونه های نرمال و هم نمونه های سرمی پاتولوژیک دارای مقدار چشمگیری از اپو – امینوترانسفراز ها هستند که با یک دوره اینکوباسیون مناسب با پیریدوکسال فسفات به هولوانزیم فعال تبدیل میشوند.

یک مطالعه از فرمولهای کوانزیم ها و گروه های پروستتیک نشان میدهد که بسیاری از انها ساختارهایی دارند که از ویتامین ها گرفته شده اند.بنابراین بخش نیکوتین امید از NAD و NADP از ویتامین نیاسین (niacin) گرفته شده است در حالی که گروه پروستتیک پیریدوکسال 5- فسفات امینوترانسفرازها یک مشتقی از پیریدوکسین (pyridoxine , vitamin B6) است.دیگر مشتق های ویتامین های گروه B در واکنشهای انزیمی شرکت میکنند.

 

انزیم شناسی انالیزی (analytical enzymology)

از نظر انالیزی یک ازمایشگاه بالینی درگیر در اندازه گیری فعالیت یا جرم انزیم در سرم یا پلاسما است که بیشتر درون سلولی بوده و یا اینکه تنها در مقادیر کم وجود دارند.با اندازه گیری تغییرها در غلظت این انزیم ها در بیماری ها این امکان وجود دارد که مکان و ماهیت تغییر اسیب شناختی را در بافتها شناسایی کرد.

 

اندازه گیری سرعت واکنش (measurement of reaction rates)

سرعت واکنش کاتالیز شده به وسیله انزیم بطور مستقیم متناسب با مقدار انزیم فعال موجود در سیستم است.در نتیجه تعیین سرعت واکنش تحت شرایط تعریف شده و کنترل شده اندازه گیری مقدار انزیم را در یک نمونه مانند سرم فراهم میکند.

تعیین سرعت واکنش شامل اندازه گیری کینتیک مقدار تغییر ایجاد شده در یک فاصله زمانی معین است.هم روش اندازه گیری زمان ثابت (fixed-time) و هم پایش پیوسته (continuous-monitoring) برای اندازه گیری سرعت واکنش کاتالیز انزیم استفاده میشود.در روش زمان ثابت (fixed-time) مقدار تغییر ایجاد شده به وسیله انزیم پس از اینکه واکنش در پایان یک بازه زمانی ثابت ایستاد اندازه گیری میشود.در روش پایش پیوسته (continuous-monitoring) پیشرفت واکنش بطور پیوسته پایش میگردد.این دو روش هرکدام برتری ها و محدودیت هایی دارند.

پیشرفت تبدیل سوبسترا به محصول ها در حضور یک انزیم با اندازه گیری غلظت کاهش یابنده سوبسترا و یا غلظت افزایش یابنده محصول ها پایش میشود.اندازه گیری تشکیل محصول بهتر است چرا که تعیین افزایش در غلظت ماده ، بالاتر از غلظت کم و یا صفر بودن آن در آغاز قابل اعتماد تر است از اندازه گیری یک کاهش از یک غلظت بالای اغازین.

در لحظه ای که سوبسترا و انزیم مخلوط میشوند سرعت واکنش صفر است.سپس سرعت واکنش به سرعت به یک مقدار بیشینه میرسد که برای دوره ای از زمان ثابت باقی میماند( شکل 15-10).

در طی زمانی که سرعت واکنش ثابت است سرعت واکنش تنها به غلظت انزیم بستگی دارد و بطور کامل به غلظت سوبسترا وابستگی ندارد. در این زمان گفته میشود که کینتیک انزیم از درجه صفر ( zero-order kinetic) پیروی میکند،چون سرعت واکنش متناسب با توان صفر (zero power) غلظت سوبسترا است.در پایان همینطور که سوبسترای بیشتری مصرف میشود سرعت واکنش کاهش می یابد و به فاز وابستگی درجه اول (first-order dependance) به غلظت سوبسترا وارد میشود.دیگر فاکتورهایی که در کاهش سرعت واکنش همکاری دارند شامل انباشت محصول ها است که ممکن است نقش مهارکنندگی داشته باشند، مهم شدن واکنش برگشت و حتی دناتوراسیون انزیم.اگر چه امکان دارد که بتوان سرعت های واکنش ایجاد شده به وسیله مقدارهای مختلف یک انزیم را تحت شرایط از نوع درجه اول مقایسه کرد اما بطور اشکار استاندارد کردن چنین مقایسه هایی هنگامی که غلظت انزیم تنها متغیری است که بر سرعت واکنش اثر میگذارد اسانتر است.بنابراین سنجش های انزیمی معمولا در شرایطی انجام میشوند که غلظت سوبسترا در اغاز اشباع است.سرعت واکنش طی فاز درجه صفر (zero-order phase) با اندازه گیری محصول تولید شده در یک مدت زمان ثابت اینکوباسیون جایی که سرعت ثابت باقی میماند انجام میشود.در شکل 15-11 به نمایش درامده است.

 

اندازه گیری سرعت های واکنش در هر بخشی از نمودار A نتیجه ای میدهد که با سرعت اغازین یکسان است.با این حال نمودار B از خطی بودن خود در تمام نمودار فاصله گرفته و اندازه سرعت ها با زمان افت میکند.در نمودار C نتیجه های درست تنها زمانی بدست میاید که سرعت در طول بخش II اندازه گیری شود.نتیجه های درست در صورت اندازه گیری سرعت در فاز Lag (I) و در فاز III به دست نمی اید.

انتخاب دقیق شرایط واکنش مانند غلظت سوبستراها و کوفاکتورها نمودار پیشرفت واکنش را بهبود می بخشد، فاز Lag را حذف میکند میزان خطی بودن را افزایش میدهد بنابراین روش زمان-ثابت برای انالیز مناسب میشود.بهبود در تکنیک های نوری منتهی به اندازه گیری های مطمین و حساس تشکیل محصول شده است و نیز سبب شده مدت زمان اینکوباسیون در مقایسه با سنجش ها در گذشته کوتاه تر شود.همچنین این امر سبب افزایش در زمانی شده که طی آن فعالیت انزیم اندازه گیری میشود.

با این حال یک حد بالا در اندازه گیری فعالیت در همه روشهای زمان-ثابت وجود دارد که بالاتر از آن پیشرفت نمودار دیگر خطی نیست.در این مورد مقدار تغییر اندازه گیری شده بالای گستره زمان-ثابت دیگر نمایانگر شرایط سرعت از درجه صفر نخواهد بود.

 

حد بالای فعالیت پذیرفته شده در یک روش اصلاح نشده باید طوری انتخاب شود که نمونه هایی با اندازه فعالیتهای زیر آن با یک درجه بالایی از اطمینان بک نمودار پیشرفت خطی به دست دهند، یا بعبارتی دیگر اگر بازه فعالیت خیلی کوچک تعریف شود بسیاری از نمونه ها بدون اینکه نیاز باشد دوباره باید انالیز شوند.نمونه هایی که بالای گستره فعالیت هستند با کوتاه کردن مدت اینکوباسیون تا جایی که سرعت ثابت واکنش حاصل شود باید دوباره سنجش گردند. با این حال در برخی روشهای دستگاهی که مدت اینکوباسیون به وسیله پیکر بندی دستگاه ثابت است دشوار و یا ناممکن است. بنابراین لازم است که نمونه ها رقیق شوند باز با این وجود رقیق سازی ممکن است همیشه منتهی به یک تغییر متناسب در گزارش فعالیت انزیم نگردد.

از نظر تئوری سرعت اغازین واکنش همینطور که غلظت انزیم افزایش پیدا میکند بدون هیچ حدی افزایش پیدا میکند تا اندازه ای که هیچ فاکتور دیگری مانند غلظت سوبسترا محدود کننده آن نخواهد بود.در عمل سرعت واکنش در فعالیتهای بالای انزیمی چنان سریع میشود که اندازه گیری سرعت واکنش حتی با روشهای پایش پیوسته ناممکن است.بنابراین بک حد بالای فعالیت که بدون اصلاح در روش سنجش قابل اندازه گیری باشد وجود دارد حتی در روشهای پایش پیوسته اما این حد معمولا بسیار بالاتر از حد مربوط به روشهای زمان-ثابت است.بنابراین نمونه های کمتری به تیمارهای خاص نیاز خواهند داشت.دیگر اینکه روش سنجش پایش پیوسته شناسایی بخش درجه-صفر مناسب از پیشرفت نمودار را برای هر نمونه امکان پذیر میکند و نیز شناسایی نمونه هایی که نیاز به تیمار خاص دارند را نیز میسر میسازد.روشهای پایش-پیوسته بنابراین یک برتری قاطعی را در سنجش انزیمی فراهم اورده اند و هرگاه نیاز باشد باید استفاده شوند.

 

اندازه گیری سوبستراها (measurement of substrates)

مقدار سوبسترای تبدیل شده به محصول طی یک واکنش انزیمی را میتوان با روشهای انالیز مناسب مانند اسپکتروفتومتری ،فلورومتری، و یا کمی لومینسانس اندازه گیری کرد.برای مثال اگر یک واکنش انزیمی با یک تغییر در ویژگی های جذبی برخی اجزای سیستم سنجش در گستره فرابنفش و یا دیداری انجام شود میتوان آنرا در طی پیشرفت واکنش دید.واکنشهای خود شناساگری(self-indicating reaction)  از این دست با ارزش هستند چون پایش پیوسته انها امکان پذیر است.نمونه مهمی از واکنشهای خود شناساگر تعیین فعالیت دهیدروژناز با پایش تغییر در جذب در 339 (340) nm کوانزیم NADH یا NADPH طی اکسیداسیون یا کاهش است و نمونه دیگر اندازه گیری فعالیت ALP به وسیله یون پارا-نیتروفنولات زرد رنگ از پارا-نیترو فنیل فسفات در محلول بازی است. این واکنشهای شناساگر چنان پرکاربرد هستند که از انها در واکنشهای جفت شده (coupled reactions) به فراوانی استفاده میشوند تا یک تغییر نوری قابل دیدن را برای واکنش اصلی که چنین تغییری در آن وجود ندارد فراهم سازند.

با معرفی اسپکتروفتومترهای بر پایه منشور یا گریتینگ انکساری که توانایی جداسازی یک پرتو باریک از نور تک رنگ در طیف فرابنفش یا دیداری را دارند و نیز به کمک فتومالتی پلایرهای پایدار و حساس به عنوان اشکارساز تکرارپذیری اندازه گیری های فتومتری بسیار بهبود پیدا کرده است.در پایان اینکه بکارگیری جذب مولی (molar absorptivity) محصول های یک واکنش به خوبی تعریف شده (مانند NADH) هنگام محاسبه تغییرات در غلظت آنها بر بایه اندازه گیری با اسپکتروفتومتر مرسوم است.با این حال صجت جذب و طول موج اسپکتروفتومتر باید بطور منظم بررسی شود.

 

مناسب سازی،استاندارد سازی و کنترل کیفیت (optimization,standardization and quality control)

برای اندازه گیری فعالیت انزیم بطور قابل اعتماد همه عامل هایی که بر سرعت واکنش اثر میگذارند – غیر از غلظت انزیم فعال – نیاز است که مناسب سازی و به سختی کنترل شوند.دیگر اینکه چون سرعت واکنش در بیشینه سرعت و یا نزدیک به آن و تحت شرایظ مناسب اندازه گیری میشود بنابراین یک سیگنال انالیزی بزرگتری به دست میدهد که میتوان انرا به درستی (accurately) و به دقت (precisely) انداره گرفت تا یک سیگنال کوچکتر که تحت شرایط کمتر مناسب (suboptimal) به دست میاید.بنابراین تلاش های زیادی شده است تا شرایط مناسب برای اندازه گیری فعالیت انزیم های دارای اهمیت بالینی تعیین شود.

 

مناسب سازی (optimization)

مناسب سازی شرایط واکنش برای سنجش انزیمی به طور سنتی با تغییر یک فاکتور تک و بررسی اثر آن روی سرعت واکنش و سپس انجام دوباره ازمایش با فاکتور دوم و به همین شیوه انجام میشود تا اینکه اثر همه متغیرها بررسی گردد.یک ترکیب مناسبی (optimal combination) از متغیرها بر پایه این ازمایش ها گزینش شده و اعتبار (validity) شرایط گزینش شده بررسی میشود.این شیوه بررسی نه تنها کار سختی است بلکه پیاده کردن آن هنگامی که متغیرهای گوناگون به هم وابسته هستند همانطوری که در مورد بسیاری از انزیم ها پیش میاید بسیار سخت است.این شیوه تجربی سنتی در مناسب سازی با تکنیک های تازه تر simplex-co-optimization  و response-surface methodology جایگزین گردیده است.

 

استاندارد سازی (standardization)

برخلاف تلاشهای چشمگیر انجام شده یک شیوه جهانی و فراگیر در اندازه گیری فعالیت یک انزیم مفروض تا کنون بدست نیامده است.در نتیجه تلاش های استاندارد سازی کنونی انزیم ها بر توسعه سیستم هایی تمرکز کرده است که اجازه مقایسه ازمایش ها را مستقل از روش اندازه گیری فراهم میکند.برای دست یابی به آن یک سیستم مرجع (reference system) بر پایه مفاهیم ردگیری اندازه شناختی (metrologic traceablity) و بر پایه سلسله مراتب روشهای انالیزی پیشنهاد گردیده است.یک روش مرجع (reference procedure) و مواد مرجع تایید شده (certified reference materials) پایه زنجیره ردگیری اندازه شناختی را شکل میدهند.(شکل 15-12).

به عنوان بخشی از این سلسله مراتب روشهای مرجع در 37 C  برای انزیم های بیشتر معمول توسعه داده شده اند و یک گروه از ازمایشگاه های مرجع گزینش میشوند تا اندازه گیری های انزیمی را در یک سطح بسیار بالای اندازه شناختی انجام دهند.

روشهای مرجع ، استاندارهای دقت (precision) و صحت (accuracy) را تعریف میکنند و دیگر روشهای انجام مرتبط که برای استفاده معمول (routine use) طراحی میشوند به وسیله آنها قضاوت میشوند.روش مرجع برای نسبت دادن یک مقدار تایید شده (certified value) به مواد مرجع (reference material) مورد استفاده قرار میگیرد.سپس از این مواد تایید شده تولید کنندگان برای ارزش گذاری کالیبراتورهای تجاری (commercial calibrators) بهره میگیرند که ردگیری مقدارهای بدست امده در ازمایشگاه را فراهم میکند.

چندین مطالعه نشان داده که فراورده های انزیمی با ویژگی های تکرارپذیر و خلوص و پایداری مطمین میتواند تولید گردد.این فراورده ها ممکن است از منبع های جانوری که انزیم های آنها بسیار همانند همتاهای منبع انسانی خود هستند فراهم گردد،اگر چه امکان های جدید به وسیله انتقال ژن و تکنیک های نوترکیب(recombinant techniques) ایجاد شده است.

برای اینکه یک سیستم مرجع توانایی استاندارد کردن نتایج سنجش های مختلف از یک فعالیت انزیمی را داشته باشد برخی شرایط باید فراهم گردد.اول اینکه روش مرجع بکار برده شده برای ارزش گذاری مواد مرجع و نیز روش (های) معمول (routine methods) که باید کالیبر شوند می بایست اختصاصیت (specificity) یکسانی برای انالیت انزیم چه به شکل ایزوانزیم و چه در شکل ایزوفرم تحت مطالعه ، باید داشته باشد.دوم اینکه ویژگی های مواد کالیبراتور باید همانگونه و یا بسیار نزدیک به ویژگی های انالیت انزیم در ماتریکس طبیعی (natural matrix) و یا قادر به تبدیل شدن به یک چیز دیگر و هم ارز با نمونه های سرم انسانی  باشد.

 

کنترل کیفیت (quality control)

بکارگیری برنامه های کنترل کیفیت همانند دیگر انالیزهای بالینی در انالیز انزیم ها ضروری است اگر قرار است که نتایج در تشخیص و درمان مفید و کاربردی باشند.

فراورده های لیوفیلیزه و مایع که دارای انزیم های مختلفی هستند از منابع تجاری مختلف در دسترس هستند و این ها عملکردی کاربردی در کنترل کیفیت دارند.

 

اندازه گیری غلظت جرمی انزیم (measurement of mass enzyme concentration)

در بسیاری از روشهای ایمونواسی جرم پروتیینی انزیم ها و ایزوانزیم های انسانی بجای فعالیت کاتالیزی انها اندازه گیری میشود. برای طراحی چنین سنجش هایی پروتیین خالص شده انزیم لازم است که 1) به عنوان کالیبراتور عمل کند 2) نشاندار شود 3) برای برانگیختن انتی بادی اختصاصی ضد انزیم بکار رود.این روشها همه مولکولهای دارای شاخص های انتی ژنی لازم برای شناخت توسط انتی بادی ها را شناسایی میکند بنابراین مولکولهای انزیم غیر فعال که از نظر ایمونولوژیکی دست نخورده هستند همراه مولکولهای فعال اندازه گیری میشوند.این روش هنگامی مفید است که برخی انزیم های گوارشی مانند تریپسین دارای پیشتازهای غیر فعال و یا دارای مهارکننده های فعالیت کاتالیزی در پلاسما هستند.در بسیاری از موارد هیچ تخریب و یا تغییری در انزیم فعال در درون خون رخ نمیدهد و بنابراین در روشهای مختلف اندازه گیری هم ارزی بالینی ( هم ارزی فعالیت کاتالیزی و غلظت جرمی ) دیده میشود.

ایمونواسی بطور طبیعی نمی تواند برای تعیین فعالیت کلی بیشتر انزیم های تشخیصی مهم بکار رود چون این سنجش ها بطور کلی از نظر سرعت ،دقت و هزینه قابل رقابت با اندازه گیری های دستگاهی برای فعالیتهای کاتالیزی انزیم ها نمی باشند.دیگر اینکه چندین فعالیت انزیمی در سرم ناشی از مخلوطی از شکل های مشخص ایمونولوژیکی می باشد و بنابراین یک سنجشی که از یک نوع انتی بادی بهره میگیرد تنها یک شکل انزیمی را شناسایی میکند .با وجود عیب در تعیین فعالیت کلی انزیم یک برتری برجسته در اندازه گیری ایزوانزیم ها و ایزوفرم ها خاص دارد و این روشهای ایمونولوژیکی اهمیت ویژه ای در انالیز ایزوانزیم ها به منظور تشخیص دارد.

 

انزیم ها به عنوان ریاجنتهای انالایتیکال (enzymes as analytical reagents)

از انزیم ها به عنوان ریاجنتهای انالایتیکال برای اندازه گیری چندین متابولیت و سوبسترا و در ایمونواسی برای تشخیص و اندازه گیری واکنشهای ایمونولوژیکی استفاده میشود.

 

اندازه گیری متابولیتها (measurement of metabolites)

استفاده از انزیم ها به عنوان ریاجنتهای انالایتیکال برای اندازه گیری متابولیتها برتری اختصاصی بودن به ماده مورد اندازه گیری را میدهد.این اختصاصیت بسیار بالا نیاز به جداسازی اولیه و یا مرحله های استخراج را حذف میکند و بنابراین انالیز بطور مستقیم روی مخلوطهای پیچیده ای مانند سرم میتواند انجام شود.یوریکاز (یورات اکسیداز ) ،اوره از و گلوکز اکسیداز نمونه هایی از انزیم های بسیار پیچیده هستند که در سنجش های مهم بالینی مانند اندازه گیری اسید اوریک ، اوره و گلوکز در مایع های زیستی استفاده میشوند.با اینحال اختصاصیت بالا همیشه در عمل دست یافتنی نیست و اگاهی از اختصاصیت به سوبسترا برای انزیم ها بنابراین برای پیش بنی تداخل های احتمالی در سنجش و اصلاح آن ضروری است.بیشتر واکنش های جفت شده برای ساخت یک سیستم انالیزی انزیمی استفاده میشوند تا یک ترکیب ویژه تعیین گردد.یک نمونه از این واکنش ها اندازه گیری گلوکز به وسیله واکنش هگزوکیناز است.هگزوکیناز قندهایی غیر از گلوکز را به استرهای 6 – فسفات مربوطشان تبدیل میکند.با این حال واکنش شناساگر (indicator reaction) که برای پایش این تغییر بکار میرود واکنشی است که توسط گلوکز 6-فسفات دهدروژناز کاتالیز میشود.گلوکز 6-فسفات دهیدروژناز انزیمی است بسیار اختصاصی برای سوبسترایش و بنابراین فرایند کلی برای اندازه گیری گلوکز بسیار اختصاصی است.

در عمل هر دو روش تعادل و کینتیک طراحی شده اند که از انزیم ها به عنوان ریاجنت استفاده میکنند.

روش های تعادل (equilibrium methods)

بیشتر سنجش ها برای تعیین مقدار یک سوبسترا که به صورت انزیمی بکار برده میشوند اجازه پیشرفت تا حد کامل شدن را می یابند به این ترتیب همه سوبسترا به محصول اندازه گیری شونده تبدیل میشود.به این روشها روش نقطه پایانی (end point method) و یا درست تر روشهای تعادل (equilibrium methods) گفته میشود چون هنگامی که واکنش به تعادل رسید باز می ایستد.واکنشهایی که در آن نقطه تعادل در پایان به تبدیل همه سوبسترا می انجامد اشکارا برای این نوع انالیز مناسب است.با این حال یک تعادل نامناسب اغلب میتواند در یک جهت غیر دلخواه به وسیله واکنشهای انزیمی و یا غیر انزیمی جابجا شود ،واکنشهایی که محصول واکنش اول را تبدیل و یا به دام می اندازند( برای نمونه در اندازه گیری لاکتات به وسیله لاکتات دهیدروژناز،پیروات تشکیل شده میتواند با افزودن هیدرازین (hydrazine) به هیدرازون (hydrazone) برگشت ناپذیر تبدیل شود).

از نظر تئوری زمان مورد نیاز برای تبدیل یک مقدار ثابت Q از سوبسترا به محصول ها بطور معکوس متناسب است با مقدار انزیم E که :

که k1 ثابت سرعت است و t زمان سپری شده است .روشهای تعادل بنابراین نیازمند استفاده از مقدارهای کافی از انزیم برای هر نمونه است تا از زمان های اینکوباسیون زیاد که دلخواه نیست پرهیز شود.همانطور که غلظت سوبسترا در زمان نزدیک به پایان واکنش به مقدارهای کم میرسد Km  انزیم در تعیین سرعت واکنش نقش برجسته ای پیدا میکند.انزیم هایی با میل ترکیبی بسیار بالا برای سوبستراهایشان در انالیز تعادل بسیار مناسب می باشند.روشهای تعادلی نسبت به تغییر های اندک در شرایط واکنش بسیار غیر حساس هستند.نیاز نیست که بطور دقیق مقدار یکسانی از انزیم در مخلوط واکنش استفاده شود و یا اینکه pH و دما بطور مطلق ثابت باشند تنها اگر در صورتی که تغییرها انچنان بزرگ نباشند که واکنش در زمان ثابت تعیین شده تمام نشود.

 

روشهای کینتیک (kinetic methods)

واکنشهای درجه اول (first-order) و یا درجه اول کاذب (pseudo-first -order) بیشترین واکنشهای مهم در تعیین غلظت سوبسترا به شیوه کینتیک است.در بسیاری از واکنشهای درجه اول غلظت سوبسترا S در یک زمان معین t پس از اغاز واکنش به وسیله معادله زیر اندازه گیری میشود.

که ] S0 [ غلظت سوبسترای اغازین است و  e پایه لگاریتم طبیعی است و k ثابت سرعت است.

تغییر در غلظت سوبسترا Δ [ S ] در یک بازه زمانی ثابت t1 تا t2 در ارتباط است با [S0] و بر طبق رابطه زیر

در این معادله نشان میدهد که تغییر در غلظت سوبسترا در یک بازه زمانی ثابت بطور مستقیم متناسب است با غلظت اغازین سوبسترا .این یک ویژگی عمومی واکنشهای درجه اول است.

در بسیاری از واکنشهای انزیمی ، کینتیک درجه اول هنگامی جستجو میشود که [S] در مقایسه با Km کوچک است بنابراین

ثابت سرعت درجه اول k برابر است با  Vmax / Km .

روشهایی که در آن برخی ویژگی های مرتبط با غلظت سوبسترا ( مانند جذب ،فلورسانس ،کمی لومینسانس و همانند اینها ) که در دو زمان ثابت طی واکنش اندازه گیری میشود ،روشهای کینتیک دو نقطه ای (two- point kinetic methods) گفته میشود.از نظر تئوری این روشها صحیح ترین روشها برای تعیین سوبستراها به روش انزیمی است. با این حال این روشها از نظر فنی نسبت به روشهای تعادل بیشتر استفاده میشوند و همه فاکتورها که بر سرعت واکنش اثر میگذارند مانند pH، دما و مقدار انزیم باید از یک سنجش تا سنجش بعدی همانطور که زمان دو اندازه گیری ثابت است باید ثابت نگه داشته شوند.این شرایط به اسانی در انالایزرهای خودکار دست یافتنی است. یک محلول مرجع از انالیت (سوبسترا) باید برای کالیبر کردن استفاده شود.برای اطمینان از شرایط واکنش درجه اول غلظت سوبسترا باید در مقایسه با Km پایین باشد ( بعبارت دیگر به اندازه کمتر از 0.2 * Km).بنابراین انزیم هایی با اندازه Km بالا در انالیزهای کینتیک، برای بدست اورن یک بازه کاربردی گسترده تر از غلظتهای سوبسترا بهتر هستند.

 

سنجش با مولکولهای ایمنی (immunoassay)

در انزیم ایمونواسی (enzyme immunoassay) ،انتی بادی ها و یا انتی ژن های نشاندار شده با انزیم، ابتدا با لیگاند واکنش داده میشوند و سپس سوبسترای انزیم به انها افزوده میشود.انزیمهایی مانند 1) ALP  2) پراکسیداز ترب کوهی (horse raddish peroxidase = HRP)  3) گلوکز 6-فسفات دهیدروژناز (G6PD)  4) بتا-گالاکتوزیداز همگی به عنوان لیبل های انزیمی بکار میروند.شکل اصلاح شده ای از این روش سنجش بر پایه جذب مولکولهای ایمنی متصل به انزیم (enzyme-linked immuonosorbent assay = ELISA) است که در آن یکی از اجزای واکنش به سطح فاز جامد متصل میشود.در این روش یک بخش از نمونه با انتی بادی فاز جامد برهم کنش میدهد.پس از شستشو یک انتی بادی دوم نشاندار شده با انزیم افزوده میشود تا یک کمپلکس Ab-Ag-Ab تشکیل شود.انتی بادی نشاندارشده با انزیم که بصورت ازاد (free) و مازاد (excess) است شسته شده و سوبسترا افزوده میشود،تبدیل سوبسترا متناسب با میزان انتی ژن است.در ایمونواسی ها اختصاصیت انزیم های نشاندار مهم نیست بلکه حساسیت انها مهم است.

 

کاربردهای انالیزی انزیم های نامتحرک شده (analytical application of immobilized enzymes)

در برخی انالیزهای انزیمی،مصرف انزیمی با بکارگیری انزیم های نامتحرک (immobilized) شده که میتوانند در چندین انالیز دوباره استفاده شوند کاهش یافته است.انزیم های نامتحرک شده بصورت شیمیایی به مواد جاذب (adsorbent) مانند 1) میکروکریستالین سلولز (micro crystalline cellulose)  2) دی اتیل امینواتیل سلولز (diethylaminoethyl cellulose = DEAE)  3) کربوکسی متیل سلولز (carboxymethyl cellulose)  4) اگاروز (agarose) متصل میشوند.گروه های دیازو (diazo) ، تریازین (triazine) ، و ازاید (azide) برای اتصال پروتیین های انزیمی به ماتریکس نامحلول استفاده میشوند تا ذراتی را تشکیل دهند که در تماس با محلول سوبسترا هستند و یا سطوحی را تشکیل دهند که در تماس با محلول سوبسترا هستند مانند یک غشا (membrane) و یا یک پوششی (coating) روی سطح درونی یک لوله ای که محلول سوبسترا را در بر گرفته است،تشکیل دهند.از بین انزیم های در دسترس به شکل نامتحرک شده 1) اوره از (urease)  2) هگزوکیناز (hexokinase)  3) الفا -امیلاز (α-amylase)  4) گلوکز اکسیداز (glucose oxidase)  5) تریپسین (trypsin)  6) لوسین امینو پپتیداز (leucine aminopeptidase) می باشد.پایداری در برابر گرما و دیگر غیرفعال کننده ها بطور چشمگیری در مقایسه با انزیم های در درون محلول افزایش یافته است.انزیم های پروتئولایتیک (proteolytic enzyme) در این روشها در معرض خودخواری (autodigestion) نیستند.با این حال برخی ویژگی های انزیمی مانند Km و pH مناسب آنها ممکن است تغییر یابد.تکنیک های الکتروشیمی مانند 1) پتانسیومتری (potentiometry)  2) پولاروگرافی (polarography)  3) مبکروکالریمتری (microcalorimetry) از برتری های انزیم های نامتحرک شده استفاده کرده اند(فصل 11 را ببینید).انزیم های درج شده در درون غشاها بخشی ار الکترودهای انزیمی را میسازند.سطح یک الکترود حساس به یون با یک لایه از ژل پر روزنه طوری پوشانده میشود که یک انزیم درون آن پلیمریزه گشته است.هنگامی که الکترود درون یک محلول از سوبسترا سوبسترای مناسب غوطه ور میشود عملکرد انزیم یونهایی تولید میکند که الکترود به آنها حساس است.برای نمونه یک الکترود اکسیژن با یک لایه که دارای گلوکز اکسیداز است پوشانده میشود و به این وسیله میزان گلوکز از میزان اکسیژن مصرفی در واکنش تعیین میشود.اوره به وسیله ترکیب یک الکترود حساس به یون امونیوم و یک غشا دارای اوره از براورد میشود.

اندازه گیری ایزوانزیم ها و ایزوفرم ها (measurement of isoenzymes and isoforms)

شماری تکنیک های انالیزی برای اندازه گیری ایزوانزیم ها و ایزوفرمهای انزیمی استفاده شده اند. این ها شامل 1) الکتروفورز  2) کروماتوگرافی  3) غیرفعال سازی شیمیایی و 4) تفاوت در ویژگی های کاتالیزی ، اما بیشترین روشهای استفاده شده بر پایه روشهای ایمونوشیمیایی بوده است.

 

الکتروفورز (electrophoresis)

شکل های مختلف الکتروفورز برای جداسازی ایزوانزیم ها استفاده شده اند اما بطور کلی بطور معمول بکار برده نمیشوند چون زمان بر و سخت از نظر اندازه گیری و بطور نسبی گران هستند.ایزوالکتریک فوکوسینگ در جدا کردن ایزوفرم هایی که از نظر میزان رزیدیو های قندی متصل شده بصورت کووالانسی مانند سیالیک اسید تفاوت دارند بطور موفقیت امیزی عمل کرده است.

 

کروماتوگرافی (chromatography)

کروماتوگرافی تعویض یون از تفاوت در بار مولکولی خالص در یک pH مفروض بهره میگیرد تا ایزوانزیم ها را جدا کند.یک ماده معمول برای تعویض یون DEAE سلولوز است که در آن گروه های قابل یونیزه DEAE به ماتریکس سلولوز خنثی (inert) متصل شده اند.کروماتوگرافی تعویض یون بطور کلی به اندازه زون الکتروفورز (zone electrophoresis) پروتیین های بسیار همانند هم را نمی تواند جداسازی نماید اما بطور نسبی مقدار زیادی از پروتیین ها را میتواند با یک بازیابی خوبی از نظر فعالیت انزیمی جدا نماید. بنابراین این روش دارای ارزش بسیاری در تخلیص انزیم ها است.

دیگر شکل های کروماتوگرافی که در جداسازی مخلوط ایزوانزیم ها بکار برده شده اند شامل کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC) و کروماتوگرافی میل ترکیبی (affinity chromatography) است.در روش اخری (کروماتوگرافی میل ترکیبی ) از تفاوت ایزوانزیم ها در میل ترکیبی شان نسبت به یک لیگاند ویژه که به یک پایه نامحلول خنثی به عنوان فاز ثابت چسبیده است بهره میگیرد.

غیرفعال سازی شیمیایی و تفاوت در ویژگی های کاتالیزی (chemical inactivation and differences in catalytic properties)

غیرفعال سازی انتخابی تحت شرایط کنترل شده در تعیین ویژگی ایزوانزیم ها بکار برده شده است.این روش برپایه تفاوت ها در پایداری (stability) است که از تغییرهای کوچک در ساختار مولکولهای پروتیین حاصل میشود.دماهای بالا یا محلولهای غلیظ اوره یا دیگر ریاجنتها برای دناتوره کردن انزیم استفاده شده اند.سرعت غیرفعال شدن انزیمی به وسیله این عامل ها بسیار وابسته به شرایط ازمایش است که بنابراین باید بطور سختگیرانه ای تحت کنترل باشند تا نتایج قابل مقایسه ای بین نمونه ها بدست اید.

تفاوت در ویژگی های کاتالیزی مانند 1) تفاوت در Km ، سرعت نسبی واکنش با سوبستراهای همانند ( هنگامی که اختصاصیت انزیم اجازه تنوع در ساختار سوبسترا را میدهد)  2) pH مناسب  و 3) پاسخ به مهار کننده ها ، بطور طبیعی بین ایزوانزیم ها که محصول های لوکوسهای چند ژنی هستند وجود دارد.این تفاوت ها می تواند به عنوان پایه روشهای شناسایی و اندازه گیری ایزوانزیم هایی خاص عمل کند.

بطور کلی این تکنیک ها بطور معمول استفاده نمیشوند چرا که بطور گسترده ای به وسیله دیگر روشهای بسیار اسانتری مانند روشهای ایمونواسی جایگیزین شده اند.

 

سنجشهای ایمونوشیمیایی (immunochemical assays)

روشهای ایمونوشیمیایی انالیز ایزوانزیم ها بطور ویژه ای درباره ایزوانزیم هایی که لوکوسهای چند ژنی ریشه گرفته اند کاربرد دارد چون این ها معمولا از نظر انتی ژنی بسیار مشخص هستند. به هر حال توان شناسایی انتی بادی های منوکلونال همه شکل های انزیمی را مورد هدف انالیز ایمونوشیمیایی قرار داده است.برخی از این روشها استفاده از فعالیت کاتالیزی ایزوانزیم ها را بکار گرفته است.برای نمونه فعالیت باقی مانده (residual activity) ممکن است پس از واکنش با یک انتی سرم اندازه گیری شود.رادیوایمونواسی که در آن ایزوانزیم با یک ردیاب (tracer) رادیواکتیو نشاندار شده است و با یک ایزوانزیم غیرنشاندار بر سر جایگاه های اتصال انتی بادی رقابت میکند برای اندازه گیری ایزوانزیم ها استفاده شده است.این روش ها به فعالیت کاتالیزی ایزوانزیم هایی که شناسایی میشوند بستگی ندارد.با این حال با طراحی سیستم های ایمونواسی خودکار معمول ترین روش اندازه گیری ایزوانزیم هایی مانند CK-MB الایزا بر پایه فاز جامد است.