فصل سوم - مراحل الایزا

فصل 3

مراحل الایزا

این فصل اطلاعات عمومی در مورد ویژگی های عملی وضروری الایزا را ارایه میدهد . این ویژگی ها درذیل  خلاصه شده اند.

1. جذب انتی ژن یا انتی بادی به فاز جامد پلاستیک
2. اضافه کردن نمونه مورد ازمایش و ریاجنتهای بعدی
3. اینکوباسیون واکنشگرها
4. جداسازی واکنشگرهای متصل و واکنشگرهای آزاد به وسیله مرحله شستشو
5. اضافه کردن ریاحنت نشاندار شده با انزیم
6. اضافه کردن سیستم تشخیص انزیمی (ایجاد رنگ)
7. خوانش سنجش با چشم یا به وسیله اسپکتروفوتومتر

1

فاز جامد

بیشترین فاز جامد مورد استفاده ،پلیت های میکروتیتر 96 چاهک از جنس پلی وینیل کلراید (پلیت های انعطاف پذیر) یا  پلی استایرین ( پلیت های سخت غیر انعطاف پذیر) است.بسیاری از تولید کننده ها، پلیت های طراحی شده برای الایزا را تامین و محصولات استانداردی را فراهم میکنند.استفاده از انواع گسترده ای از پلیت ها از تولید کنندگان مختلف گزارش شده که در طیف وسیعی از تحقیقات بیولوژیکی بکار برده شده اند.ممکن نیست که یک محصول خاص را به عنوان پلیت مورد قبول جهانی توصیه کرد.در موارد طراحی سنجش های خاص هوشمندانه است که از پلیت توصیه شده استفاده کنیم با این حال چون درعمل تفاوت نسبتا کمی بین پلیت ها وجود دارد ممکن است که همان سنجش را با استفاده از پلیت های متفاوت که استاندارد مناسبی را تامین میکنند بکار گرفت.در این رابطه ازمایشگاههایی که با تعداد زیادی از انواع الایزا سروکار دارند که در آنها از انتی ژنها و انتی بادی های مختلف استفاده میشود می توانند سنجش های استاندارد شده را با استفاده از پلیت های یکسان انجام دهند. چاهک های ته صاف بیشتر توصیه میشوند چرا که خوانش اسپکتروفتومتری در ارزیابی رنگ ایجاد شده بهتر انجام میشود.با این حال چاهک های ته گرد راهم میتوان در موارد ارزیابی الایزا بصورت چشمی استفاده کرد .چنین پلیت هایی را هم میتوان با اسپکتروفتومتر خواند اما برای این کار ایده ال نیستند.

کارایی پلیت ها برای سنجشهای مفروض به شیوه ای معمول باید مورد ارزیابی قرار گیرد چون نمی توان فرض کرد که پلیتها در عملکرد فرق ندارند .به ویژه هنگامی که سری ساختهای مختلفی از پلیتها تهیه میشود. معمولا  شماره ساخت از روی جعبه ای که پلیت ها در آن تعبیه شده است و همچنین از مستندات همراه پلیت ها قابل دستیابی هستند.بعضی پلیتها کد هایی دارند که روی پلاستیک حک شده است تا نشان ویژه ای که در تولیدشان استفاده میشود شناسایی گردد.درعمل گاهی اوقات پلیت هایی با کیفیت ضعیف حتی با گواهی ضمانت بیرون فرستاده میشوند.

 

1.1

نا متحرک کردن انتی ژن روی سطح فاز جامد

ویژگی کلیدی درالایزای فاز جامد این است که انتی ژن ها یا انتی بادی ها خیلی راحت به سطوح به شیوه جذب و چسبیدن غیر فعال می چسبند.این فرایند معمولا پوشاندن (coating) نامیده میشود.بیشتر پروتیین ها ،احتمالا در نتیجه برهم کنش های هیدروفوبی بین زیر ساختار های غیر قطبی پروتیین و ماتریکس سطوح پلاستیک می چسبند.این برهم کنش ها مستقل از بار خالص پروتیین ها است وهر پروتیین  یک ثابت اتصال متفاوت دارد.میزان آبگریزی برهم کنش پلاستیک - پروتیین را میتوان بخدمت گرفت و به این وسیله اتصال را افزایش داد چرا که بیشتر رزیدوی (بخشی از ساختار پروتیین که در پیوند پپتیدی شرکت ندارد) آبدوست پروتیین ها در بیرون و بیشتر رزیدوی هیدروفوب انها به سمت داخل جهت گیری کرده اند.(1).

دناتوره کردن جزیی بعضی از پروتیین ها منجر به در معرض قرار گرفتن نواحی هیدروفوب و محکم تر شدن برهم کنش با پلاستیک میشود.این فرایند را میتوان با قرار دادن پروتیین ها در پ هاش پایین یا دترجنت ملایم و سپس دیالیز آن در برابر بافر های کوتینگ قبل از کوت کردن آنها انجام داد.

میزان و وسعت کوتینگ به عوامل زیر بستگی دارد.

1. ضریب انتشار مولکولهای جذب شونده
2. نسبت ناحیه سطح کوت شونده  به حجم محلول کوت کننده
3. غلظت ماده ای که قرار است جذب سطح شود
4. دما
5. مدت زمان فرایند جذب سطحی

این عوامل به هم متصل هستند. تعیین غلظت مناسب انتی ژن برای کوت کردن به وسیله تیتراسیون ،در هر سیستمی بسیار مهم است.یک محدوده غلظتی بین 1 تا 10 میکروگرم در میلی لیتر از پروتیین در یک حجم 50 میکرولیتر راهنمای خوبی برای میزان پروتیین مورد نیاز جهت اشباع سازی مکانهای موجود روی پلیت پلاستیک میتواند باشد.این امر وقتی قابل اعتماد تر است که انتی ژن نسبتا خالص باشد (عاری از دیگر پروتیین های هدف ایمونواسی).در نتیجه غلظت می تواند با فعالیت مرتبط باشد.با این حال هنگامی که محلول کوت کننده حاوی مقدار نسبتا کمی از انتی ژن(ها) مورد نیاز است مقداری که به چاهک می چسبد در تناسب با نسبت آن در مخلوط کاهش می یابد.دیگر پروتیین های ناخالصی مکانهایی را روی پلاستیک اشغال میکنند.از آنجایی که پلاستیک یک حد اشباع نهایی دارد استفاده از انتی ژنهای نسبتا ناخالص برای کوت کردن ،منتهی به سنجش های ضعیف میشود.

 

باید مراقب بود و اثرات اتصالی پروتیین را در غلظتهای مختلف ارزیابی کرد چرا که تراکم واقعی اتصال ممکن است نتایج را تحت تاثیر قرار دهد.اتصال پرتراکم انتی ژن ،بخاطر ممانعت فضایی ممکن است به انتی بادی اجازه اتصال را ندهد(مولکولهای انتی ژن بسیار نزدیک هم متراکم شده اند).غلظتهای زیاد انتی ژن هم ممکن است سبب افزایش انباشته شدن یا لایه لایه شدن شده و منتهی به برهم کنش ناپایدار ریاجنتهای بعدی شود.جهت گیری و غلظت مولکولهای انتی بادی باید مورد توجه قرار گیرد چرا که این عوامل فعالیت سنجش را تحت تاثیر قرار میدهند.شکل های 1 و 2 عناصر جذب سطحی را بررسی میکند.

 

1.2

زمان و دمای کوتینگ

میزان برهم کنشهای هیدروفوب به دما بستگی دارد.هرچه دما بیشتر باشد میزان برهمکنش هم بیشتر است.تنوع زیادی در شرایط اینکوباسیون وجود دارد.باید به خاطر داشت که هر عاملی بر کوتینگ اثر دارد برای مثال غلظتهای زیاد پروتیین ممکن است زمان اینکوباسیون کمتری را بخواهد وغلظت کمتر انتی ژن به مدت زمان زیادتری نیاز داشته باشد.معمول ترین روش شامل اینکوباسیون در 37 درجه به مدت 1 ساعت یا به مدت تمام شب در 4 درجه سانتی گراد است و یا ترکیبی از هر دو تا و یا اینکوباسیون (غیر دقیقتر)دردمای اتاق به مدت 1 ساعت(برای مطالعه Ref.2 را ببینید)می باشد.وضعیتهای زیادی وجود دارد و در نهایت  اینکه هر محققی باید یک انتی ژن ویژه را تا به دست آوردن روشی استاندارد تیتر نماید.افزودن دما ممکن است تاثیرات مخربی روی انتی ژن(ها) در مرحله کوتینگ داشته باشد و این انتخابی است چون بعضی انتی ژنها در مخلوط تحت تاثیر قرار میگیرند و بعضی دیگر نه.چرخاندن پلیتها بطو ر قابل ملاحظه ای زمان مورد نیاز برای کوتینگ را بوسیله افزایش میزان تماس بین مولکولهای کوتینگ و پلاستیک کاهش میدهد. 

1.3

بافر کوتینگ

بافرهای کوتینگ که بیشتر استفاده میشوند بافر کربنات 50 میلی مولار با pH 9.6 یا 20 mM tris-HCl با pH 8.5 ویا بافر نمکی فسفات 10mM با pH 7.2 (2). .بافرهای کوتینگ مختلفی باید در موقع روبرو شدن با مشکل بررسی ویا در هنگام شروع طراحی با هم مقایسه شوند.از نقطه نظر تئوری بهتر است از بافری با یک pH 1 تا 2 واحد بالاتر از نقطه ایزوالکتریک (pI) پروتیینی که قرار است بچسبد ،استفاده شود.این کار در عمل خیلی راحت نیست چون انتی ژن ها اغلب مخلوطی از پروتیین های پیچیده هستند.با مطالعه مستقیم اثر pH های مختلف و قدرتهای یونی اتصال بیشتری از پروتیین ممکن است مشاهده شود.افزایش در قدرت یونی به 0.6 M NaCl درترکیب با یک pH مناسب، نتایج بهتری در اتصال پپتیدهای ویروسی هرپس سیمپلکس مشاهده شده است(3).

 

پروتیین هایی با بخشهای اسیدی بیشتر نیاز به pH های پایین تر برای خنثی سازی نیروهای عقب ران بین پروتیین ها و فاز جامد دارند انطور که درref 3 نشان داده شده است وشرایط کوتینگ مناسب برای این پپتیدها pH بین 2.5 تا 4.6 است .PBS با pH 7.4 نیز برای کوتینگ بسیاری از انتی ژنها مناسب است .کوتینگ و سپس خشک کردن پلیتها در 37 درجه سانتی گراد با استفاده از بافرهای ناپایدار تبخیرشونده (کربنات امونیوم) و در PBS اغلب موفقیت امیز است به ویژه وقتیکه نمونه ها نسبتا ناخالص هستند.بعضی از انتی ژنها مشکلات ویژه ای را تحمیل میکنند مانند بعضی پلی ساکاریدها ،لیپوپلی ساکاریدها و گلیکولیپیدها .

 

درمواردی که ثابت میشود کوتینگ مستقیم چاهکها با ریاجنت ممکن نیست ، لازم است چاهکها در ابتدا با یک انتی سرم اختصاصی کوت شوند.بنابراین حالت ساندویچ (به دام انداختن) باید طراحی شود.جذب سطحی غیرفعال اگرچه الزاما نه در عمل ولی چندین عقب گرد تئوریک نیز دارد. این ها شامل کنده شدن ،ظرفیت اتصال ،و اتصال غیر اختصاصی است.

1.4

کنده شدن

بخاطر ماهیت غیرکووالانسی برهمکنش پلاستیک/پروتیین ، کنده شدن (نشت) ممکن است طی مراحل سنجش رخ دهد.با این حال اگر شرایط استاندارد شود نشت ،بقای سنجش را تحت تاثیر قرار نمیدهد.گزارش هایی وجود داردکه شدت شستشو در مراحل مختلف سنجش (شامل مراحل پس از کوتینگ) سنجش را از طریق حذف پروتیین ها تحت تاثیر قرار میدهد.با این حال من با این مشکل برخورد نکرده ام.

 

1.5

ظرفیت اتصال

مهم است بدانیم که سطح پلاستیک یک ظرفیت نهایی برای جذب دارد.ظرفیت چسبیدن پروتیین ها به چاهکهای میکروپلیت با ماهیت دقیق پروتیین هایی که جذب پلیت میشوند تحت تاثیر قرار میگیرد.سطح اشباع بین 50 تا 500 نانوگرم ،در حجم 50 میکرولیتر به ازای یک چاهک ، مشخص شده است که برای بسیاری از پروتیین ها معتبر است. چسبیدن وزن موثرپروتیین به ازای یک چاهک درصورتی افزایش میابد که حجم پروتیین چسبنده افزایش یابد ، در واقع به این ترتیب میزان سطح پلاستیک در تماس با انتی ژن کوت کننده افزایش یافته است .درمواردی که تفاوت واضحی بین غلظت واقعی پروتیین اضافه شده (درمواردی که معلوم است )ومقادیری که جدیدا اخذ شده وجود دارد در این صورت  تیتراسیون الایزا باید دوباره انجام شود.بنابراین اگر غلظتهای 1 تا 10 میلیگرم در میلی لیتر (یا بیشتر) از نمونه برای کوت کردن چاهکها لازم باشد ، این یک حالت ایده ال نیست.

1.6

اتصال غیر اختصاصی

برخلاف برهم کنش انتی ژن /انتی بادی جذب سطحی یک فرایند غیر اختصاصی است.بنابراین هر ماده ای ممکن است در هر مرحله ای طی سنجش به پلاستیک بچسبد.این موضوع باید در طراحی سنجش در نظر گرفته شود چون ممکن است  ریاجنتها با چنین موادی واکنش دهند.مقدارهای زیاد اتصال غیر اختصاصی را می توان از طریق تغییر سیستم و بر مبنای جذب سطحی مستقیم انتی ژن و استفاده از تکنیک های ساندویچ برطرف نمود ، دراین شیوه انتی بادی های اختصاصی انتی ژنهای اختصاصی را به دام انداخته و تغلیظ میکنند.

 

1.7

چسباندن انتی ژن بطور کووالانسی

چند ماده شیمیایی که پروتیین ها را به پلاستیک می چسبانند استفاده شده است تا از کنده شده پروتیین ها جلوگیری شود، انتی ژنها در این روش بصورت کووالانسی متصل میشوند.اینها شامل مواد محلول در آب چون کاربودی ایمین ها (carbodiimines)،استرهای ایمیدو و سوکسین ایمیدیل(imido – and succinimidylesters) ،اتان سولفونیک اسید (ethanesulfonic acid)و گلوتارالدهاید(glutaraldehyde) است.پیش کوتینگ پلیتها با پلی مرهای با وزن مولکولی بالا مانند پلی گلوتارالدهاید و پلی لایزین راه چاره دیگری است (4.5) . این ها پلیمرها به پلیتها با کارایی بالایی می چسبند و به عنوان مولکولهای چسبنده غیر اختصاصی عمل میکنند.این روش به ویژه برای انتی ژنهای دارای کربوهیدرات بالا مفید است چون این مولکولها بطور طبیعی بسیارضعیف به پلاستیک متصل میشوند.

بطو رکلی بدون نیاز به اتصال کووالانسی انتی ژنها به پلیتها می توان سنجشهای موفقی را طراحی کرد.پلیتهای تیمار شده خاص و فعال از نظر واکنش پذیری شیمیایی هم اکنون در دسترس هستند.با استفاده از پروتیین های چسبیده بطور کووالانسی امکان استفاده مجدد از پلیت ها مقدور میشود. بعد از سنجش ، تمام ریاجنتهای متصل شده به پروتیین های چسبیده به فاز جامد با یک روش شستشوی نسبتا شدید مانند pH پایین شسته میشوند.ماهیت کووالانسی اتصال ها که انتی ژن فاز جامد را حفظ میکند از حذف آن از محیط جلوگیری میکند.این روش انتی ژنیسیته ریاجنت چسبیده به فاز جامد را از بین نمی برد و پلیتها را میتوان بعد از تعدیل با بافرهای شستشوی طبیعی دوباره استفاده کرد.

 

2

شستشو

هدف از شستشو این است که ریاجنتهای متصل شده را از متصل نشده (ازاد) جدا کنیم.این کار شامل خالی کردن چاهک ها از ریاجنتها و به دنبال آن اضافه کردن مایعی به داخل چاهکها است.چنین فرایندی حداقل سه بار برای هر چاهک انجام میشود. مایع بافری مورد استفاده در شستشو معمولا PBS(0.1 M , pH 7.4) است تا ایزوتونیسته را حفظ نماید به این خاطر که بیشتر واکنشهای انتی ژن /انتی بادی تحت چنین شرایط مناسبی عمل میکنند.اگرچه از PBS بیشتر استفاده میشود اما بافرهای فسفات با مولاریته پایین (0.01 M) هم ممکن است استفاده شوند و مشخص شده که کارامدی سنجش تحت تاثیر قرار نمیگیرد.این بافرها همچنین کم هزینه تر هم هستند.

در بعضی از سنجش ها اب شیر معمولی برای شستشو استفاده میشود.این کار توصیه نمی شود چون آب شیر معمولی از نظر محتویات بسیار متغیر است (pH،مولاریته ،و غیره ).با این حال ممکن است سنجش هایی طراحی شده باشد که اب تاثیر قابل توجهی روی اجزای تست نگذارد.بطور کلی عمل مکانیکی پرکردن چاهک ها با یک محلول کافی است که چاهکها را از ریاجنتهای متصل نشده بشوید .بعضی از محققین محلول شستشو را در چاهکها برای مدت کوتاهی، (زمان خیساندن)پس از هر اضافه کردن باقی میگذارند(1 تا 5 دقیقه).بعضی مواقع دترجنتها  به ویژه Tween 20  (0.05 %) به محلول شستشو اضافه میشود.این مواد باعث مشکلاتی میشود مثلا حبابهای ایجاد شده باعث شستشویی ضعیف میشود و هوای به دام افتاده از تماس محلول شستشو با سطح چاهک ها جلوگیری میکند.هنگام استفاده از دترجنتها باید مواظب بود که دترجنت اثرات بد روی ریاجنت ها نمی گذارد ( انتی ژن را دناتوره نکند) و بیشتر اینکه، از کف کردن در چاهک ها جلوگیری شود. روشهای شستشو در ادامه می اید.

 

2.1

شیوه های خیساندن

تمام پلیت در حجم زیادی از بافر فرو برده و خیسانده میشود .این شیوه سریع است اما احتمال الودگی متقاطع بین پلیتهای مختلف وجود دارد.همچنین باعث افزایش هزینه محلول شستشو میشود.

2.2

بطری های شستشو

مایع از یک بطری پلاستیکی شستشو با یک نازل تخلیه کننده منفرد ریخته میشود که روشی آسان و ارزان است.دراینجا چاهکها تک تک و پی در پی پر می شوند و انگاه با سرو ته کردن ،محتویات به داخل سینک یا ظرف حاوی مواد ضد عفونی کننده، تخلیه میشوند.این فرایند حداقل سه بار تکرار میشود.محلول شستشو حداقل برای 30 ثانیه قبل از تخلیه کردن ،ممکن است درچاهکها باقی بماند.

 

2.3

بطری های شستشو با نازلهای تخلیه چندتایی

این تجهیزات اساسا همانطوری است که در زیر عنوان 2 مطرح شده است ،بجز اینکه یک دستگاه تخلیه کننده چند تایی به خروجی بطری چسبیده است . این دستگاه قادر است در یک زمان 8 چاهک را پر نماید.

2.4

پی پتهای چند کاناله

از پی پتهای چندکاناله د رالایزا استفاده میشود تا چاهک ها را به دقت پر کنند.محلول های شستشونیزدر مخزنهایی ریخته میشود.

2.5

مخزنهای بزرگ شستشو

استفاده از مخزن های بزرگ برای محلول شستشو راحت است .در اینجا یک نازل چندتایی به مخزن از طریق تیوب وصل میشود به طوری که سیستم توسط نیروی جاذبه تغذیه شود.باید مراقب بود که محلول با این حجم زیاد به میکروب ها آلوده نمی شود.

2.6

دستگاههای ویژه شستشوی دستی

دستگاههای شستشوی دستی بطور تجاری موجود هستند وقادربه پرکردن همزمان و تخلیه کردن چاهکها توسط یک دستگاه نازل چند تایی دستی می باشند. کار با این ها آسان است اما به تجهیزات ایجاد مکش نیاز دارند.در شستشوی دستی پلیت ها مهمترین عامل این است که هر چاهک طوری با محلول شستشو پر شود که هیچ حبابی در چاهک به دام نیفتد ویا اینکه انگشت دست روی چاهکهای گوشه ای را نپوشاند.بعد از شستشوی نهایی تمام چاهک ها خالی شده و آنگاه محلول شستشوی باقی مانده کاملا تخلیه میشود.این عمل با بر عکس کردن چاهک ها و ضربه زدن پلیت روی یک سطح جاذب مانند دستمال کاغذی ،دستمال کتانی ،یا مواد اسفنجی انجام میشود.بنابراین مایع بطور فیزیکی به بیرون رانده شده و جذب سطحی میشود که نرم بوده و از آسیب دیدن پلیت جلوگیری میکند.

2.7

شستشو دهنده های خاص پلیت ها

شستشو دهنده های خاص پلیتها تجهیزات نسبتا گرانی هستند که چاهک ها را پر و خالی میکنند.چندین چرخه شستشو قابل برنامه ریزی هست.این تجهزات دارای مزیتهای بزرگی هستند به ویژه هنگام بررسی پاتوژن ها در الایزا که در نتیجه آن آلودگی ناشی از ذرات کاهش می یابد.دربیشتر روشهایی که شامل اضافه کردن محلول ها بطور دستی وخالی کردن پلیتها با پرت کردن به داخل سینک است باید این فرایند خطرناک درنظر گرفته شود بویژه اگر پاتوژنهای انسانی مطالعه میشوند و درمرحله کوتینگ ،آنتی ژن زنده بکار میرود.همچنین بخاطر داشته باشید که آنتی ژنهای زنده می توانند مکانهایی از آزمایشگاه را که کشت بافتی در آنجا استفاده میشود آلوده کنند.نگه داری دقیق چنین ماشین هایی ضروری است چون خطاهای ماشینی مانند انسداد دریک نازل وجود دارد.

 

 

3

اضافه کردن ریاجنتها

درایمونواسی توزیع صحیح ریاجنتها در حجم های نسبتا کوچک انجام میشود.حجم های معمول در الایزا در محدوده 50 تا 100 میکرولیتر در هر چاهک برای ریاحنتهای عمومی و  2 تا 10 میکرولیتر برای نمونه هاست.لازم است که کاربر کاملا با تکنیک های پی پت کردن آشنا باشد و ارتباط بین گرم ،میلی گرم،میکروگرم،نانوگرم و معادل های آن را برای حجم مانند لیتر ،میلی لیتر و میکرولیتربداند.بنابراین تا وقتی دانشی در مورد اینکه چگونه می شود محلول 0.1 مولار را ساخت هیچ سنجشی قابل انجام نخواهد بود.توانایی ساخت رقت های صحیح، قبل از وارد شدن در الایزا یا هر مطالعه بیولوژیک دیگری نیز بی نهایت مهم است(برای مثال یک رقت 50/1 از انتی سرم داریم اما نیاز به ساخت رقت 3500/1 در حجم نهایی 11 میلی لیتراست).

 

3.1

پی پت ها

 استفاده از پلیتهای میکروتیتر به خوبی با پی پتهای چند کاناله همراه شده است . این پی پتهای چند کاناله تخلیه ریاجنتها را از طریق کانالهای 4 ،8 و  12 تایی بصورتهای ثابت یا متغیر در حجم های 25 تا 250 میکرولیتر فراهم می سازند.

میکروپی پتهای تک کاناله نیز لازم هستند که 5 تا 250 میکرولیتر را تخلیه میکنند.معمولا نمونه ها از مخازن طراحی شده مناسب که 30 تا 50 میلی لیتر محلول را در خود جای میدهند توسط میکروپی پت ها تخلیه میشوند.

لوازم شیشه ای عمومی ازمایشگاهی نیز لازم است مانند بطری های شیشه ای یا پلاستیکی 5 تا 25 میلی لیتر و پی پتهای 1 ، 5 و 10میلی لیتر.

 

3.2

ارزیابی کارایی پی پت

خطای پی پت کردن اغلب علت عمده نتایج نامعتبر سنجش در ازمایشگاه تشخیصی است.یک تکنیک کنترلی ساده برای دور زدن این مشکل پیشنهاد میشود.در شروع هر روز کاری پی پت ها باید از نظر گرد و غبار و کثیفی روی سطوح بیرونی بررسی شوند.توجه ویژه ای باید به نوک سمپلر شود.ازهیچ حلال دیگری غیر از اتیل الکل 70%نباید برای تمیز کردن پی پت استفاده کرد.

3.2.1

ارزیابی کوتاه مدت کارایی:

کنترل کالیبراسیون پی پت با استفاده از نوک های مدرج

این ازمایش تنها چند دقیقه طول خواهد کشید اما کاملا شما را مطمین میکند که خطای پی پت کردن در پی پت رخ نمیدهد.

1. حجم پی پت را انطور که دستورات شرکت سازنده مشخص کرده است تنظیم نمایید
2. روی جایگاه مربوط یک نوک را محکم قرار دهید
3. حجم خاص از آب مقطر را به داخل نوک بکشید
4. نوک پر شده از اب مقطر را بصورت عمودی برای چند ثانیه نگه دارید.

 

 

1. نشت را بررسی کنید
2. بررسی کنید که حجم کشیده شده مطابق با حجم مشخص شده در نوک مدرج است .
3. مراحل 1 تا 6 را حداقل پنج مرتبه تکرار کنید.
4. تکنیک های پی پت کردن را بصورت معکوس و غیر معکوس انجام دهید.

 

 

3.2.2

ارزیابی بلند مدت کارایی

کنترل کالیبراسیون پی پت با استفاده از روش جاذبه سنجی کالیبراسیون

اگر پی پت هر روز استفاده میشود باید هر سه ماه یکبار بررسی شود .با استفاده از روش جاذبه سنجی کالیبراسیون (جدول 1 را ببینید)پی پت باید از نظر نشت ،صحت و دقت بررسی شود.

صحت و دقت به راحتی با فرمول ارایه شده در زیر عنوان های2.2.1 و2.2.2 محاسبه میشود.برخلاف نرم افزار کامپیوتری کالیبراسیون پی پت، فاکتور تبدیل چگالی آب معلق در هوا در دما و فشار ازمایش منظور نمیگردد.برای کالیبراسیون پی پتهای چند کاناله هر کانال باید جداگانه ازمایش شود.

 

صحت

(انطور که برای این مبحث تعریف شده است)

یک پی پت درصورتی صحیح است که حجم تخلیه شده برابر با حجم اختصاص یافته باشد .صحت بصورت، میانگین اندازه گیریهای مکرر بیان میشود.

 

               E%=[(V-V0) / V0] * 100

E% عبارت است از صحت ، V عبارت است حجم میانگین ، V0 عبارت است از حجم اسمی

 

دقت

(انطور که برای این مبحث تعریف شده است)

دقت یعنی تکرار پذیری نمونه های توزیع شده .بصورت ضریب تغییرات بیان میشود(cv%).

CV%=(S/W)*100

که در آن S = انحراف معیار است و W = میانگین اندازه گیری ها

تجهیزات مورد نیاز

تجهیزات ذیل مورد نیاز است

1. دماسنج کالیبر شده برای اندازه گیری دمای آب
2. آب مقطر
3. ظرف شیشه ای با 10 تا 50 برابر حجم مورد ازمایش
4. ترازوی کالیبرشده
5. پی پت (علامت دار)و نوک ها

ازمایش را روی یک سطح عاری از لرزش ،پوشیده شده با یک ماده صاف ،تاریک و ازمواد غیر تزیینی. در محیطی عاری از غبار انجام دهید.

 

روش کار

1. حجم پی پت را انطور که در دستورالعمل نشان داده شده تنظیم نمایید
2. یک نوک پی پت را محکم در جایگاه قرار دهید
3. حجم اختصاص یافته از اب را به داخل نوک بکشید
4. نوک پر شده از اب را بطور عمودی برای چند ثانیه نگه دارید و نشت را بررسی کنید
5. اب مقطر را به داخل یک بشر از پیش وزن شده تخلیه کنید و وزن را به نزدیکترین عدد به یک دهم یک میلی گرم گرد کنید  .حداقل پنج مرتبه اینکار را تکرار کنید
6. نتایج را محاسبه کنید(صحت و دقت )
7. نتایج را ثبت کنید

از نظر تئوری مقدارهای صحت و دقت باید صفر باشد.توجه داشته باشید که هر چه حجم اختصاص یافته انتخاب شده برای ارزیابی کوچکتر باشد اثرات تغییرات حجم روی صحت و دقت بزرگتر است.بنابراین کار خوبی است که نتایج صحت و دقت برای حجم خاصی از پی پت روی نمودار داده ها در زمان رسم شود.

در اخر،شما باید تصمیم بگیرید که چه سطحی از صحت و دقت باید در ازمایشگاه شما پیاده شود.این بستگی دارد به اینکه از پی پت برای چه منظوری استفاده میشود.برای تهیه نمونه های قسمت شده بانک سرمی خطای پی پت کردن موضوع قابل ملاحظه ای نیست. با این حال درالایزا بهترین دقت و صحت برای پی پت کردن یک حجم کوچک مثلا 10 میکرولیتر برای تهیه رقتهای کنژوگه اماده به کار لازم است ،این را بخاطر داشته باشید که اگر شما بجای 10 میکرولیتر 5 میکرولیتر پی پت کنید ، یک رقت کنژوگه اماده به کار دوبرابر رقیق شده خواهید داشت و متعاقبا نتایج غیر قابل اعتماد سنجش را خواهید داشت.به عنوان یک قانون ، خطای حجمی 1% برای حجم های  10 میکرولیتر در ازمایشگاههای تشخیصی قابل پذیرش است.

 

دوباره کالیبر کردن پی پت ها

برای دوباره کالیبر کردن پی پتها به دستورات شرکت سازنده مراجعه یا با نمایندگی های خدمات دهی تماس بگیرید.

 

2.3

مشکل یابی پی پت

 

3.نوک ها

بعد از میکروپلیت نوکها مهمترین جنبه الایزا هستند و نیز از اجزای گران آن محسوب میشوند.چند هزار نوک ممکن است در توزیع ریاجنتها مصرف شود .بسیاری از شرکتهای سازنده ، نوک ها را تامین میکنند بنابراین دقت کنید، نوک هایی را انتخاب کنید که مناسب پی پت های میکروتیتر موجود باشند.

نوک های پی پت چند کاناله که در جعبه های خاص 96 نوک را در قالب میکروپلیت قرار داده اند ،نیز در دسترس هستند.نوک ها را می توان هم اکنون بصورت جعبه ای (گران ) خرید و انگاه جعبه ها را با دست ، از نوکهای خریداری شده پر کرد.نوک های استریل در قالب جعبه ای نیز موجود هستند.بطور کلی نوک ها نباید مستقیما با دست برداشته شوند.وقتی که جعبه ها را جابجا میکنید یا نوکها را در پی پت ها قرار میدهید دستکش های پلاستیکی باید بپوشید تا از الوده شدن نوک ها جلوگیری شود.

در نوکهایی که برای توزیع کردن توسط پی پتهای تک کاناله استفاده میشود باید دقت نظر ویژه ای شود .در مواردی که حجم های کوچکی (5 تا 20 میکرولیتر) پی پت میشوند نوک های توصیه شده توسط سازنده پی پت را باید بکار ببرید.لازم است نوک ها محکم روی پی پت جا بگیرند و محکم با دست روی پیپت سوار شوند.

 

( پرهیز از تماس با انتهای آنها) .در استفاده از پی پت های چند کاناله وقتی که نوک ها را از جعبه ها بر میدارید ممکن است یک یا دو نوک مانند بقیه محکم جا نگیرد که سبب خطا در پی پت کردن میشود.کاربر باید یک بررسی چشمی هم از حجم های نسبی برداشته شده داشته باشد.

برای صرفه جویی در هزینه ،نوک ها را می توان بعد از شستشو وارد چرخه مصرف کرد.با این حال توصیه میشود نوک هایی که در تماس با کنژوگه انزیمی بوده وارد چرخه نگردند و این ها باید جدا از دیگر نوک ها که در سایر مراحل الایزا بکار میرود قرار گیرند.شستشوی نوکها باید شدید باشد ترجیحا در اسید قوی یا محلول های دترجنت قوی و بدنبال آن در آب مقطر آبکشی شوند.هزینه / منفعت شستشو باید به دقت بررسی شود چون تولید مقدارهای کافی از اب مقطر گران است.نوکها باید بطور منظم بررسی شوند و موارد اسیب دیده باید دور انداخته شوند.شکل 3 بعضی جنبه های عملی پی پت کردن در الایزا را مثال میزند .توجه کنید که اموزش در تکنیک های پی پت کردن بینهایت در کارامدی الایزا حیاتی است.

3.4

سایر تجهیزات

چندین شرکت سازنده تجهیزات میکروتیتررا تامین میکنند مانند نگاه دارنده های لوله و نوکهای بسیار ریز .مورد اخیر از یک جعبه پلاستیکی تشکیل شده است که 96 لوله پلاستیکی با ظرفیت حدود 1 میلی لیتر را میتواند در خود جای دهد.این لوله ها دقیقا درهمان قالبی جا گذاری میشوند که پلیت های میکروتیتر نگه داری میشوند و نمونه ها در این لوله ها ذخیره یا رقیق شده و آنگاه پی پت های چند کاناله برای انتقال سریع از این لوله ها بکار میروند.نگه دارنده های نوک ها هم بهمین شکل هستند، طوری که این نوکها برای پی پت های چند کاناله در قالب 96 چاهک نگهداری میشوند تا روی آنها در گروههای 8 یا 12 تایی به سرعت جاگذاری شوند.مخازن مختلفی با 8 یا 12 کانال برای جداسازی ریاجنت ها نیز موجود است .از این ها برای اضافه کردن ریاجنتهای جداگانه بطور همزمان استفاده میکنند.

 

4

اینکوباسیون

واکنش بین انتی ژنها و انتی بادی ها به نزدیک شدن آنها بهم متکی است . در الایزا این پدیده به عواملی مانند غلظت ،توزیع ،زمان و دمای اینکوباسیون و pH (وضعیت بافری) مرتبط است.در هر بر هم کنشی اویدیتی انتی بادی ها برای انتی ژن ها نیز مهم است .دو نوع وضعیت اینکوباسیون معمول است : 1 . اینکوباسیون پلت در حال چرخش (همراه با تکان دادن) و 2.اینکوباسیون پلیت ساکن.این وضعیت ها بر زمان و دمای لازم برای یک الایزای موفق اثر داشته و بنابراین بطور جداگانه بحث میشوند.

تاثیر پلیتهای درحال چرخش بر واکنشگر ها این است که کاملا طی زمان اینکوباسیون مخلوط میشوند.از آنجایی که  فاز جامد ناحیه سطح در دسترس برای واکنشگرها را محدود میکند ، هم زدن اطمینان میدهد که مولکولهای واکنش دهنده بطور پیوسته درتماس با فاز جامد هستند.

4.1. اینکوباسیون ریاجنتها در حالیکه پلیت ها درحال چرخش هستند

طی اینکوباسیون ساکن این امر صادق نیست و هم خوردن تنها بواسطه  انتشار ریاجنتها رخ میدهد.بنابراین برای اینکه بیشترین واکنش ریاجنتها را در وضعیت ساکن داشته باشیم زمان اینکوباسیون طولانی تری لازم است  در مقایسه با زمانی که پلیت در حال چرخش است.این امر به ویژه زمانی مهم است که نمونه های بسیار ویسکوز مانند سرم 20/1 مورد بررسی قرار میگیرد.این نشانگر 5% پروتیین سرمی است و انتشار تمام انتی بادی ها  به سمت فاز جامد ممکن است زمان زیادی طول بکشد .از این زمان می توان با چرخش طی اینکوباسیون اجتناب کرد.بطور مشابه وقتی قرار است مقادیر کمی از واکنشگرها سنجیده شود زمان تماس این مولکولها به واکنشگر فاز جامد ،به وسیله هم خوردن در زمان اینکوباسیون بسیار زیاد شده است.تجهیزات چرخاننده قابل اطمینان با ظرفیت بسیار بالا برای پلیت ها موجود است.هم زن هایی با ظرفیت محدود (مانند چهار پلیت) نیز موجود است.

 

 

 

 

شکل 4 مزیت های چرخش را نشان میدهد.با هم زدن ،انجام الایزا مستقل از ملاحظات دمایی ممکن میشود.بر هم کنش انتی بادی ها و انتی ژن وابسته به  نزدیک شدن آنها است که طی چرخش بیشتر تسهیل میشود.اینکوباسیون ساکن متکی بر انتشار مولکلوها و بنابراین وابسته به دما است.بنابراین استاندارد سازی وضعیت دما در مقایسه با وضعیتی که چرخش بکار میرود، بسیار مهم است.

اثر دما نیز با مشکلاتی همراه است بخصوص وقتی که پلیتهای زیادی طی اینکوباسیون روی هم قرار می گیرند چون پلیتها بسته به جایگاه آنها در طبقه به میزان های متفاوت گرم میشوند.چاهک هایی که در درون قرار گرفته اند نسبت به آنهایی که در بیرون واقع شده اند زمان زیادی برای رسیدن به تعادل نیاز دارند و دما اثر مستقیمی بر بر وضعیت انتشار داشته و در نتیجه الایزا تحت تاثیر قرار میگیرد.این مشکل با چرخاندن پلیت برطرف میشود به این دلیل که شانس یکسانی برای تماس مولکولها در تمام چاهک ها وجود دارد.

 

4.2

وضعیت اینکوباسیون ساکن

سنجش ها ممکن است در وضعیت ساکن طراحی شوند اگر چه ممکن است در زمان و دمای دقیق متفاوت باشند.دمای اینکوباسیون معمولا بیشتر، 37 درجه ، دمای اتاق (روی میز) و 4 درجه است است.معمولا زمان اینکوباسیون تحت وضعیت ساکن تعیین میکند که چه دمایی برای اینکوباسیون استفاده شود.بنابراین در 4 درجه، اینکوباسیون طولانی تری باید داده شود(تمام شب) .بطور کلی در بیشتر اینکوباسیون های سنجش های ساکن ، واکنش انتی ژن وآنتی بادی 1 تا 3 ساعت در 37 به طول میانجامد.گاهی اوقات این وضعیت ها با هم ترکیب میشوند برای مثال یک ریاجنت اضافه میشود به مدت مثلا 2 ساعت 37 درجه و بدنبال آن یک اینکوباسیون تمام شب در 4 درجه انجام میشود به این دلیل که برنامه کاری اسانی به این صورت فراهم میشود.

 

وقتی اینکوباسیون در دمای اتاق انجام میشود باید دقت شود که تغییرات فصلی  ازمایشگاه تحت نظر باشد چون دماها کاملا متفاوت هستند به ویژه در کشورهایی که دما به شدت تغییر میکند. از تابش مستقیم نور خورشید باید پیش گیری شود همینطور از سایر منابع گرمایی مانند دیگر دستگاههای ازمایشگاه.همانطور که پیشتر بیان شد چگونگی قرار گرفتن پلیتها طی اینکوباسیون ساکن باید مورد توجه قرار گیرد . ایده ال این است که باید جدا بوده و روی هم قرار نگیرند.

در سنجش ها پلیتها باید بطور یکسان مدیریت شوند و نباید تکان خوردن یا ضربه خوردن پلیت ها رخ دهد (شامل ضربه تصادفی یا جابجایی ناگهانی توسط دیگر پرسنل)چرا که این باعث هم خوردن بیشتر و تداخل در میزان نسبی انتشار مولکولها در پلیتهای مختلف می شود. نحوه برخورد تعریف شده کارابران با سنجش ها می تواند علت اصلی تغییرات کاربر به کاربر باشد.

در شرایط هم زدن، بیشتر واکنش های انتی ژن /انتی بادی بعد از 30 دقیقه به وضعیت مناسب میرسند و سنجش ها بدون از دست دادن هیچ حساسیتی  تسریع شده اند.این امر در وضعیت ساکن صادق نیست . به نوع انتی بادی هایی که تحت وضعیت های مختلف اندازه گیری میشوند باید دقت ویژه ای شود چون الایزا به ندرت به وضعیت های تعادل کلاسیک میرسد.شکل 5 عواملی موثر بر الایزا را در وضعیت ساکن نشان میدهد.

 

5. مسدود کردن و واکنشهای غیر اختصاصی

ملاحظاتی باید انجام شود تا از اتصال غیر اختصاصی پروتیین ها به چاهک ها بعد از کوتینگ فاز جامد توسط نمونه های اضافه شده،قبل یا در طی یا درهر دو زمان پیش گیری شود.اتصال غیر اختصاصی پروتیین می تواند با هر جایگاه پلاستیکی در دسترس که توسط ریاجنتهای فاز جامد اشغال نشده است رخ دهد.بنابراین اگر سنجشی انتی بادی های گاوی را در سرم گاوی ارزیابی میکند و پروتیین های گاوی غیر از انتی بادی های اختصاصی به فاز جامد متصل میشوند، کنژوگه ضد گاوی به این ها متصل خواهد شد و یک رنگ پس زمینه بالا ایجاد خواهد کرد.

دو شیوه استفاده میشود تا چنین اتصالاتی حذف شود.یک روش این است که غلظتهای زیادی از مواد خنثی ایمونولوژیکی را به بافر رقیق کننده ریاجنتها می افزایند .مواد اضافه شده با انتی ژن فاز جامد و با کنژوگه استفاده شده نباید واکنش دهد.عامل های بلاک کننده معمول در جدول 3 ارایه شده است و آنها با عوامل غیر اختصاصی در نمونه مورد ازمایش برای جایگاه های موجود در پلاستیک رقابت میکنند.

 

غلظت استفاده شده اغلب به رقت های نمونه بستگی دارد بنابراین اگر سرم 20/1 ازمایش میشود (5% پروتیین ) انگاه عامل های بلاک کننده باید در غلظتهای بالا حضور داشته باشند تا بطور موفقیت امیزی رقابت کنند و یا اینکه توان اتصال بیشتری درمقایسه با مواد غیر اختصاصی داشته باشند.چنین عاملهای بلاک کننده ای در یک مرحله جداگانه قبل از اضافه کردن نمونه نیز میتوانند اضافه شوند ،این شیوه سبب افزایش توان رقابت کنندگی عامل بلاک کننده میشود. دترجنت های غیر یونی نیز برای پیش گیری از جذب غیر اختصاصی استفاده میشوند .این ها در غلظتهای پایین استفاده میشوند به شکلی که برهم کنش انتی ژن و انتی بادی میسر شود.گاهی دترجنتها و مواد بلاک کننده باهم اضافه میشوند.

بهترین وضعیت برای سنجشها تنها در عمل قابل ارزیابی است ، با این حال هزینه چنین ریاجنتهایی باید در محاسبه اورده شود . پودر شیر خشک (منبع گاوی) بطور موفقیت امیزی در بسیاری از سنجش ها استفاده شده و کاملا ارزان است.اما بعضی عامل های بلاک کننده معین ممکن است برای سیستم های انزیمی مختلف نامناسب باشد.برای مثال پودر شیر خشک نمی تواند در الایزای مستقیم اوره از استفاده شود یا وقتی که سیستم های بیوتین/اویدین استفاده میشود.مواد الوده کننده ای مانند ایمونوگلوبولین گاوی (IgG) در البومین سرم گاوی (BSA) ممکن است استفاده از عامل های بلاک کننده معینی را که توسط برخی سازنده ها، تامین میشود برطرف کند.بیشتر سنجش ها تحت شرایط بلاک شده مذکور معتبر خواهند بود .با اینحال محققین ممکن است سنجش هایی را طراحی کنند که با دیگر ریاجنتهای بلاک کننده انجام شود و مواد اعلام شده حتی ممکن است گران یا قابل تهیه نباشد.

 

5.1.مکانیسم های ایمونولوژیکی غیر اختصاصی

واکنشهای بین فاز جامد ،پروتیین های بازی دارای بار مثبت و ریاجنتهای اضافه شده به علت برهم کنشهای یونی پیشتر توصیف شده است(15).این واکنش با اضافه کردن هپارین یا دکسران سولفات در رقیق کننده بر طرف میشود.بارهای مثبت را میتوان با اضافه کردن یک غلظت کم از یک دترجنت انیونی مانند سدیم دودسیل سولفات (SDS) حذف کرد.چنین بر هم کنشهایی برای کنژوگه ها هم قابل ذکراست که اگر چه به پلیتهای کوت نشده متصل نمیشوند اما قویا به پلیتهایی که محتوی انتی ژن هستند متصل میشوند.اضافه کردن تعدادی از بافرهای بلاک کننده مانند BSA ، Tween-20یا کازئین بر این مشکل غلبه نمیکند.معمولا یک غلظت بالا از سرم غیرایمن از همان گونه که کنژوگه در آن تهیه شده لازم است تا از چنین واکنشی پیشگیری کند.

 

 

5.2

مکانیسم های ایمونولوژیکی

درشمار زیادی از گزارش های واکنش انتی بادی / انتی ژن مشخص شده که در واقع چنین واکنشی رخ نداده است.این ها به عنوان واکنشهای غیر اختصاصی نامیده شده و ماهیت ایمونولوژیکی دارند.این ه انتی بادی هایی هستند که بطورطبیعی در سرم وجود دارند و به انتی بادی های دیگر گونه ها متصل میشوند.این نوع انتی بادی ها در تمام سرم ها وجود ندارند و در نتیجه مشکلاتی را در الایزا ایجاد میکنند . برای مثال انتی بادی های هتروفیلیک ثابت کرده اند که بر ضد یک اپی توپ مشترک روی قطعه F(ab)2  از IgG گاوی ، گوسفندی،اسبی ، خوکچه هندی، موشی، و میمونی عمل میکنند.(18( .روشهای غلبه بر چنین انتی بادی هایی شامل استفاده از F(ab)2 به عنوان انتی بادی به دام اندازنده است در صورتی که واکنش هتروفیلیک  بر ضد بخش Fc از IgG است و یا استفاده از مقادیر زیاد سرم نرمال بدست امده از همان گونه انتی بادی الایزا در بافر بلاک کننده می باشد.مروری بر انتی بادی های هتروفیلیک در ref 18 ارایه شده است.

.تداخل فاکتور روماتوئید

فاکتور روماتوئید (RF) می تواند باعث میزان بالایی از مثبت کاذب در الایزای غیر مستقیم شود.این عوامل مجموعه ای از انتی بادیهای کلاس IgM هستند که در افراد سالم وجود دارند اما معمولا در وضعیت های پاتولوژیک وجود دارند.این ها به بخش Fc از انتی بادی های IgG متصل میگردند که یا با انتی ژنهای مربوط خود کمپلکس تشکیل داده اند یا در شکل مجتمع وجود دارند.بنابراین هر گونه فاز جامد /IgG/RF توسط کنژوگه هایی شناسایی شود که IgM را هم می شناسند آنگاه مثبت کاذب ایجاد میشود. بر عکس اتصال RF به کمپلکس انتی ژن /IgG سبب تداخل دراتصال کنژوگه های اختصاصی به IgG میشوند و یک واکنش ضعیف تر یا واکنش کاذب در الایزا رخ میدهد.

 

5.4

مشکلات متفرقه

بسیاری از سرم ها دارای انتی بادی هایی هستند که برای اجزای سرم حیوانی اختصاصی می باشند برای مثال انتی بادی های ضد گاوی معمولا در سرم انسانی وجود دارند(19). در موارد استفاده از کنژوگه هایی که ممکن است واکنش متقاطع ناخواسته از این نوع داشته باشند باید دقت کرد.بسیاری از کنژوگه ها از پیش ، تیمار میشوند تا چنین واکنشهای متقاطع گونه ای ناخواسته برطرف شود.ریاجنتهایی برای این منظور وجود دارد که در آن اجزای سرمی از گونه های مختلف به طور کووالانسی مثلا به دانه های اگاروز متصل شده اند.این ها به سرم ها اضافه میشوند و برای مدت کوتاهی اینکوبه شده و آنگاه سانتریفیوژ میشوند.چنین دانه هایی بعد از تیمار شدن دوباره استفاده می شوند به این صورت که  اتصالات ایمونولوژیکی بین انتی ژن و جز سرمی که با آن واکنش انجام شده شکسته میشود.چنین ریاجنتهای فاز جامدی نسبت به روشهایی که در آن سرم نرمال اضافه میشود تا چنین فعالیت هایی را حذف کند مزیت بیشتری دارند چون مولکولهای انتی بادی در این روش بطور کامل از محلول حذف میشوند.

 

5.5

تیمار نمونه ها

بسیاری از ازمایشگاهها به طور معمول سرم ها را تا 56 درجه حرارت میدهند.این کار سبب مشکلاتی درالایزا می شود.گرما دادن سبب افزایش اتصالات غیر اختصاصی به پلیت ها میگردد.(ref 8 را ببینید).

 

6

کنژوگه های انزیمی

بطور ذاتی در الایزا از ریاجنتهای کنژوگه شده با انزیم استفاده میشود. آنگاه سنجش بعد از اضافه کردن سوبسترا یا ترکیبی از سوبسترا و رنگ تعیین مقدار میشود.معمولا انتی بادی ها به انزیم کنژوگه میشوند بعضی از روش ها در ادامه خواهد امد.دیگر سیستم های معمول شامل کنژوگه کردن انزیم ها به واکنش گرهای کاذب ایمنی مانند پروتیین A و G ( که به IgG پستانداران اتصال می یابند)است و یا نشاندار کردن غیر مستقیم با استفاده از سیستم های بیوتین /اویدین می باشد.چهار انزیم که به طور معمول استفاده میشود توصیف خواهد شد.جدول 4 و 5 ویژگی های انزیم ها ،سوبستراها و شرایط متوقف کردن را نشان داده است.

 

6.1

پراکسیداز ترب کوهی(Horseradish Peroxidase) با سوبسترای هیدروژن پراکسید

پراکسیداز ترب کوهی (HRP) با هیدروژن پراکسید به عنوان سوبسترا بطور وسیع استفاده میشود.HRP یک هولوانزیم با وزن مولکولی 40200 است که حاوی یک بخش فریتپروتو پروتیین به ازای یک مولکول است .اپوانزیم یک گلیکوپروتیین با 308 امینواسید و 8 زنجیره جانبی کربوهیدراتی خنثی است که از طریق رزیدیوی اسپاراژین چسبیده است.زنجیره پلی پپتیدی به تنهایی وزن مولکولی 33890 دارد و دارای 4 اتصال دی سولفید می باشد.ساختار کووالانسی متشکل از دو ناحیه فشرده است که گروه همین را ساندویچ کرده است .هفت ایزوزیم از HRP جدا شده است .اپوپروتیین ایزوزایم C (با pI 8.7 تا 9.0( اصلی ترین شکل کاتیونی است که 50 درصد HRP بسیار خالص موجود در بازار را تشکیل میدهد.مکانیسم واکنش و تغییرات طیفی کاتالیز پراکسیداز پیچیده است شامل فعالیتهای پراکسیدازی ،اکسیدازی ،کاتالیزی و هیدروکسیلازی.

 

 

برای توضیح کامل به ref 20 مراجعه کنید.سوبسترای هیدروژن پراکسید یک مهارکننده قوی نیز به حساب میاید پس غلظتهای معینی باید استفاده شود. احیای پراکسید با انزیم ،توسط دهنده های هیدروژن انجام میشود که بعد از اکسیداسیون بصورت تغییر رنگ اندازه گیری میشود.انتخاب سوبسترایی که پس از واکنش ،محلول باقی بماند، برای اینکه خوانش اسپکتروفتومتری انجام شود در الایزا لازم است.مواد شیمیایی معمول در ادامه خواهد آمد.

 

6.1.1

اورتو-فنیلن دیامین

ارتو-فنیلن دیامین (OPD) بصورت یک محلول 40 میلی گرم در 100 میلی لیتر بافر سدیم سیترات 0.1 مولار با pH 5.0 تهیه میگردد.بصورت تجاری قرصهای از قبل وزن شده موجود است.

 

 

 

6.1.2

2.2 – ازینو دی اتیل بنزوتیازولین سولفونیک اسید.

2.2 –ازینودی اتیل بنزوتیازولین  سولفونیک اسید(ABTS) در همان غلظت که OPD تهیه میشود تهیه میگردد اما در 0.1 مولار بافر فسفات/سیترات با pH 4.0 .به شکل قرص نیز موجود هستند.

 

6.1.3

5- امینو سالیسیلیک اسید

5-امینوسالیسیلیک اسید تجاری (5-AS) در 100 میلی لیتر از آب مقطر در 70 درجه به مدت 5 دقیقه به همراه هم زدن تهیه میگردد.بعد از سرد شدن در دمای اتاق ،pH محلول با استفاده از چند قطره سدیم هیدروکسید 1 مولار به 6.0  افزایش می یابد.

 

6.1.4

تترا متیل بنزیدین

غلظت مناسب سوبسترای (هیدروژن پراکسید)تترا متیل بنزیدین (TMB) بستگی به دهنده هیدروژن و فاز جامد دارد.این غلظت معمولا در ازمایشات مقدماتی تنظیم میشود اما غلظت بین 0.010 و 0.0005 % کافی است . پراکسیدهیدروژن 30% ، بصورت تجاری موجود است.تشکیل رنگ در طول موجهای مختلف اندازه گیری میشود.اگر با یک ریاجنت متوقف کننده برای جلوگیری از تغییر جذب نوری (OD) واکنش متوقف گردد طول موج مناسب ممکن است تغییر کند.ریاجنتهای متوقف کننده برای HRP محلولهای هیدروکلریک اسید یا سولفوریک اسید برای OPD و TMB است و SDS برای ABTS است.طول موج های مناسب برای خوانش، 415 نانومتر برای ABTS ، 492 برای OPD اسیدی شده (420 نانومتر برای غیر اسیدی ) ، 492 برای 5-AS و 655 برای TMB (متوقف نشده ) و 450 نانومتر (اسیدی شده ) می باشد.

 

6.2

الکالین فسفاتاز با پارا-نیتروفنیل فسفات

الکالین فسفاتاز (ALP) که در ایمونواسی استفاده میشود بطور کلی از موکوزای روده ای گاوی یا از باکتری ایشریشیا کولی تهیه شده و این منابع بطور قابل ملاحظه ای در ویژگی ها متفاوت هستند.الکالین فسفاتاز ها گلیکوپروتیین های دایمری هستند و تمام متالوانزیم های حاوی روی در آنها  حداقل دو روی (II) به ازای یک مولکول دارند. برای توضیح جزییات ساختاری و مکانیسم واکنشی انها ref20 را ببینید.الکالین فسفاتازها در بافرهایی سنجش میشوند که نوع این بافرها به منابع انزیم بستگی دارد.برای انزیم های باکتریایی، بافر tris-hcl  0.1  مولار با ph 8.1 حاوی کلرید منیزیم 0.01% استفاده میشود.برای انزیم موکوزای روده ای بافر دی اتانول امین 10%(w/w) (97 میلی لیتر در 1 لیتر محلول کلرید منیزیم 0.01%) با pH 9.8 (که با HCl تنظیم شده است) استفاده میشود.پارا –نیتروفنیل فسفات (pnpp ) درست قبل از استفاده (بصورت قرصهای از قبل وزن شده وجود دارد) با غلظت 1 mg/ml اضافه میگردد. نیتروفنل درnm 405 اندازه گیری می شود.واکنش با اضافه کردن 0.1 حجم از کربنات سدیم 2 مولار متوقف میشود .توجه کنید که فسفات غیرآلی اثر مهارکنندگی روی الکالین فسفاتاز دارد و بنابراین PBS یا بافرهای مشابه نباید استفاده شود.

 

ازسوبستراهای رنگزای دیگرنیز می توان استفاده کرد شامل فنل فتالئین منوفسفات ،تیموفتالئین منوفسفات،بتا – گلیسروفسفات و یوریدین فسفات .سوبستراهای فلوروژن را نیز می توان بکار برد مانند بتا-نفتیل فسفات، 4-متیل امبلی فریل فسفات و 3- او- متیل فلوئوروسئین منوفسفات (21).

6.3

بتا –گالاکتوزیداز با او-نیتروفنیل –بتا –دی – گالاکتوپیرانوزید

ریاجنت با اضافه کردن یک محلول حاوی 70 میلی گرم o-نیتروفنیل -بتا – دی گالاکتوپیرانوزید (ONPG) در 100 میلی لیتر از 0.1 مولار بافر پتاسیم فسفات با ph 7.0   حاوی 1 mM کلرید منیزیم و 0.01 مولار 2- مرکاپتواتانول تهیه میشود .واکنش با اضافه کردن 0.25 حجم از کربنات سدیم 2 مولار متوقف میشود.

6.4

اوره از ،تغییر pH و اندیکاتور بروموکرزل پرپل

ریاجنت با اضافه کردن محلول بافری ضعیف اوره (ph 4.0) در حضور بروموکرزل پرپل تهیه میشود. در حضور اوره از ، اوره هیدرولیز می شود تا امونیا را ازاد کند که ph محلول را افزایش می دهد و سبب تغییر رنگ از زرد به ارغوانی میگردد.با اضافه کردن 10 میکرولیتر از محلول 1% مرتیولات (تایمروسال) به هر چاهک واکنش متوقف میشود.جدول 4 و 5 ویژگی های سیستم های انزیمی مختلف را بطور خلاصه نشان میدهد.

 

7

موجود بودن کنژوگه ها

ممکن است کنژوگه ها بطور تجاری موجود باشند و یا اینکه در ازمایشگاههای فردی هم ساخته شوند. در استفاده از ریاجنت مناسب دربسیاری از سنجش ها ،باید توجه ویژه ای شود.بنابراین پیچیدگی ها و اطلاعات ایمونولوژیکی ریاجنتهای مختلف باید در نظر گرفته شود.بسیاری از کنژوگه ها برضد اجزای مختلف سرمی گونه ها تولید شده اند. بعضی از ویژگی های آنها در ادامه آمده است.

1. گونه ای که درآن انتی سرم تولید میشود مهم است.بنابراین میمون ضد IgGگاو به این معنی است که در تولید انتی سرم ضد IgG گاو از میمون استفاده شده است.دیگر مثال ها شامل rabbit anti-pig   و pig anti-dog است.
2. توضیح پیشین را باید اصلاح کرد چون هر دوی دهنده سرم و ایمونوژن معمولا در معرض تیمار ایمونوشیمیایی قرارمی گیرند.بنابراین دهنده سرم قبل از کنژوگه شدن یا(که معمول است)بطور ناخالص بخش بندی میشود یا ممکن است براساس افینیتی تخلیص شود تا کنژوگه حاصل، 100 % تنها برضد ایمونوژن واکنش دهد.به عنوان مثال : donkey IgG anticow IgG یا donkey IgG(affinity purified) anticow IgG .

 

 

این توصیف ها به پردازش سرم بعد از تولید و قبل از کنژوگه شدن می پردازد.توصیف ایمونوژن نیز دربعضی مواقع مهم است .با استفاده ازمثال اخر، IgG گاوی ممکن است قبل از تزریق به میمون ، بر اساس افینیتی تخلیص شده باشد یا اینکه بخش خاصی از یک  ایمونوگلوبولین تخلیص شده باشد تا یک انتی سرم خاص یک زیرکلاس را برانگیزد برای مثال زنجیره سنگین IgG ممکن است به حیوان تزریق شود تا کنژوگه تنها با IgG واکنش دهد.به خاطر داشته باشید که تمام کلاس های ایمونوگلوبولین انتی ژنهایی را شریک هستند بنابراین بسیار محتمل است که یک انتی سرم انگیخته شده ضد IgG از هر گونه ای IgA ،IgM را علاوه بر IgG بشناسد.بنابراین لازم است که به اختصاصیت کنژوگه در هر سنجشی توجه شود.

 

3. منابع وسری ساختهای مختلف ازکنژوگه های یک سازنده ممکن است فرق داشته باشند.بنابراین در مقیاس بزرگ خوب است که یک سری ساخت موفقی را به اندازه کافی برای تمام ازمایشات اتی تهیه کرد.یک انتی IgG که از شرکت تجاری A بدست آمده ممکن است نتایج متفاوتی از شرکت B بدهد.

کنژوگه ها باید تا شرایط مناسب تیتر گردند و در تیترهای مازاد نباید استفاده گردند .این کار در بدست اوردن نتایج قابل اعتماد بسیار حیاتی است.

 

8

کنژوگه کردن با انزیم

حساسیت انالیتیکی الایزا وابسته به توانایی انتی بادی در اتصال و فعالیت انزیم اختصاصی واکنشگر ایمنی نشاندار شده یعنی کنژوگه است.اتصال یک انزیم به یک انتی ژن یا انتی بادی ممکن است اختصاصیت یک سنجش را تحت تاثیر قرار دهد در صورتی که اصلاح شیمیایی دنباله ها، شاخصهای انتی ژنی یا جایگاههای واکنش دهنده را روی مولکولهای انتی بادی تغییر دهد.بنابراین روشهای شیمیایی که این پارامترها را تحت تاثیر قرار ندهد انتخاب شده اند.بیشتر تکنیکها اسان و راحت و به راحتی توسط غیر متخصصین علاقه مند به طراحی ایمونواسی انزیمی قابل انجام هستند.

نه تنها باید واکنشپذیری ایمنی بعد از کنژوگاسیون حفظ شود بلکه باید فعالیت کاتالیزی انزیم نیز برقرار باشد.بعد از کنژوگاسیون باید واکنش پذیری آن ازمایش شود تا معلوم شود که آیا اختصاصیت مطلوب وجود دارد یا خیر .لازم است قبل از استفاده کنژوگه در الایزا خالص سازی انجام شود تا انتی ژن یا انتی بادی غیرکنژوگه و انزیم ازاد حذف شوند.ریاجنت های مورد استفاده در تولید کنژوگه ها متنوع هستند و روش عمل آنها بصورت  تغییر گروههای عملکردی موجود در پروتیین ها ست.انتی ژنهایی که غیر پروتیینی هستند (مانند استروییدها) را با روشهای مختلف کنژوگه میکنند و در اینجا به آنها نمی پردازیم.انزیم ها به ریاجنتها یا بصورت مستقیم توسط گروههای واکنش دهنده روی انزیم وریاجنت بصورت کووالانسی متصل میشوند یا بعد از ارایه گروههای واکنش پذیر (مانند تیول یا گروههای مالئیمید) بصورت غیر مستقیم از طریق ریاجنتهای هوموبایفانکشنال (دوعملکردی یکسان ) یا هتروبایفانکشنال (دو عملکردی ناهمسان)در یک روش دو مرحله ای متصل میشوند.(22).ویژگی های یک کنژوگاسیون مناسب در ادامه می اید.

1. سادگی و سرعت
2. تکرارپذیری ( بدست اوردن نسبت ثابت مولی انزیم و ریاجنت)
3. بازده بالای ریاجنت نشاندار شده و بازده کم پلی مر های انزیم و ریاجنت
4. درجه پایین غیر فعال شدن ریاجنت و انزیم
5. روش اسان برای جداسازی ریاجنتهای نشاندار و غیر نشاندار
6. پایداری طولانی مدت بدون از دست دادن فعالیت ایمونولوژیک و انزیمی

 

.

 نشاندار کردن

معمولا سوبسترا برای این انتخاب میشود تا یک محصول رنگی ایجاد کند .میزان تشکیل رنگ در زمان معینی متناسب است با میزان کنژوگه انزیمی موجود.در سطح کینتیک ،واکنش ها با درجه کینتیک آنها تفکیک میشوند که وابستگی سرعت واکنش را به غلظت واکنشگرها مرتبط می سازد.درالایزا بطور کلی واکنش در رابطه با سوبسترا یک درجه صفر را نشان میدهد. سوبسترای بسیار کم میزان تولید محصول را محدود میکند.بنابراین سوبسترای کافی باید وجود داشته باشد تا  از محدود شدن سرعت توسط سوبسترا و یا کوفاکتورها پیشگیری شود.درمواردی که سوبسترا و دهنده های هیدروژن رنگزا برای ایجاد رنگ لازم هستند غلظتهای این دو در بدست آوردن شرایط مناسب باید ارزیابی شود.

محصول باید در یک زمان تعریف شده پایدار باشد و محصولهایی که در نورروشن یا در دماهایی که سنجش انجام میشود ناپایدار باشند نباید استفاده شوند.پارامترهای فیزیکوشیمایی که بر تشکیل رنگ اثر دارند شامل موارد زیر است .

1. اجزای بافر و pH
2. دمای واکنش
3. غلظت و پایداری سوبسترا و کوفاکتور ،پایداری محصول و پایداری انزیم
4. پایداری سوبسترا و محصول

 

9.1

پراکسیداز ترب کوهی(HRP)

HRP در طیف وسیعی از pH   با سوبسترای خود یعنی هیدروژن پراکسید، واکنش میدهد با اینحال pH مناسب برای طراحی لیبل در الایزا بسته به دهنده رنگزا فرق میکند.تغییر pH سرعت واکنش را کاهش میدهد اما کینتیک واکنش را تحت تاثیر قرار نمیدهد برای مثال افزایش pH به 5.0 برای ABTS سرعت واکنش را کاهش میدهد (pH مناسب 4.0 است) اما برخطی بودن کینتیک اثر ندارد.بیشتر بافرهایی که در ترکیب سوبسترا استفاده میشود پایه سیترات با مولاریتی پایین دارند .از آنجایی که کینتیک واکنش وابسته به pH است پایدار بودن بافر ضروری است.پایداری HRP در بافرهای مختلف متفاوت است ، در بافر سیترات 0.1 M پایداری بیشتری نسبت با بافر فسفات 0.1 M  دارد.بافر فسفات با مولاریتی بالا می تواند به ویژه در pH پایین به HRP آسیب بزند..دترجنتهای غیریونی اثر پایدار کنندگی روی فعالیت انزیمی HRPO دارند و این اثر با افزایش دمای واکنش افزایش می یابد . همچنین ثابت شده است که دترجنتها اثر پایدارکنندگی روی انزیم ها دارند.

9.2

الکالین فسفاتاز

Ap در pH قلیایی فعال است، pH مناسب بالا ی 8.0 است . بافری که با سوبسترای pnpp استفاده میشود دی اتانول امین /HCl با pH   9.6 است.منیزیوم غیرآلی برای فعالیت انزیمی لازم است.دترجنتهای غیر یونی به نظر میرسد که هیج اثری بر فعالیت انزیمی ،کاتالیز سوبسترا یا ایجاد محصول نداشته باشد. انزیم در تماس با میکروپلیت غیر فعال نمیشود.

 

9.3

اوره از

اوره از از نظر انزیمی در طیف وسیعی از pH فعال است .اختصاصیت اوره از به سوبسترایش (اوره ) تقریبا مطلق است.محلول سوبسترای اوره از حاوی اوره و یک اندیکاتور pH ، بروموکرزول پرپل در pH  4.7 است.اوره از، اوره را به آمونیا و بی کربنات کاتالیز میکند و آمونیای آزاد شده سبب افزایش در pH میشود که رنگ اندیکاتور را از زرد به ارغوانی تغییر میدهد.تولید رنگ مستقیما به مقدار اوره کاتالیز شده بستگی ندارد.از آنجایی که رنگ ایجاد شده وابسته به pH است لازم است صحت pH قبل از اضافه کردن ریاجنتها به چاهک ها بررسی شود.  همچنین لازم است که هیچ بافر قلیایی بعد از شستشو (PBS – pH 7.4) باقی نماند چون باعث تغییر رنگ می شود و اگر pbs بافر شستشو است پلیت ها باید نهایتا در آب شسته شوند.

 

9.4

دمای واکنش

تغییرات بین چاهکها در یک سنجش ، سبب تغییر درمیزان رنگ ایجاد شده میشود.به شکلی مشابه دمای متغیر سبب تغییراتی در کارایی سنجش میشود.بنابراین توصیه می شود که سوبستراها در یک دمای معین اضافه شوند و پلیت ها در شرایط یکنواخت که معمولا دمای اتاق است اینکوبه گردند.توجه کنید که این تعریف نسبتا دقیق نیست و هر ازمایشگاهی باید از این جهت ارزیابی شود چون دما در کشورهای مختلف بسیار فرق میکند.بهترین کار این است که محلولهای سوبسترای گرما دیده (یا خنک شده) وهمدما با دمای تعریف شده استفاده شوند.این کار به ویژه هنگام  استاندارد سازی سنجش بین کاربران و بین ازمایشگاه ها در شرایط زمان ثابت مهم است.

 

9.5

غلظت سوبسترا/کوفاکتور و پایداری

همانطور که پیشتر گفته شد غلظت سوبسترا باید مناسب سازی شود.معمولا برای سیستم هایی ویژه ای بیان میشود(نوشتار، کیتها و غیره ).محلولهای معینی رامیتوان ساخت و ذخیره کرد.به عنوان مثال OPD را میتوان در بافر ساخت و در ویالهای کاملا دربسته بصورت منجمد ذخیره کرد و آنگاه ذوب کرد و استفاده کرد(بعد از اضافه کردن H2O2) .اینکار نیاز به توزین مقادیر کم OPD برای حجم های کم محلول سوبسترا را برطرف میکند و به استاندارد سازی سنجش کمک میکند.استفاده از مواد شیمیایی از پیش وزن شده به شکل قرص های موجود تجاری ،نیز صحت و راحتی تولید محلول های سوبسترا را بهبود بخشیده است اگر چه این قرص ها گران هستند.

 

9.6

پایداری محصول رنگی

وقتی که سوبسترا کاتالیز شد و محصول رنگی بدست امد لازم است که رنگ پایدار باقی بماند.در بیشتر الایزاها نتایج مثبت با چشم یا با اسپکتروفتومتر به صورت مقایسه شدت رنگ (OD) با یکسری مقادیر منفی قبلا کار شده خوانده میشوند. رنگ ناپایدار ساختار رنگ را تحت تاثیر قرار میدهد.برای خوانش نتایج اسپکتروفتومتر بسیار مهم است که رنگ ایجاد شده در طیف جذبی بدون تغییر باقی بماند به ویژه هنگامی که خوانش گر میکروپلیت ،جذب رنگ ایجاد شده حاصل از اضافه شدن ریاجنتی که فعالیت بیشتر انزیمی را متوقف کرده است را میخواند. در قسمت بعد به این موضوع پرداخته شده است.

 

9.7

پایداری انزیم

انزیم هایی که در الایزا استفاده میشوند، فعالیت آنها با سوبستراهای معین پایداراست.بنابراین در یک سری ساخت یکسان از کنژوگه در یک شرایط معین، میزان بالایی از ثبات وجود دارد.

9.8

پایداری سوبسترا و محصول

 سوبستراها تنها تا اندازه محدودی در بافرهای آبی محلول هستند.امکان استفاده از بافرهای آبی/آلی با هم وجود دارد .این سیستم ازحلالها بطور قابل ملاحظه ای مقادیر بیشتری از سوبسترا را می توانند در محلول وارد کنند بهمین خاطر کاربرد آنها در الایزا هموار شده است.بطور جزیی یا کلی محصولات نامحلول در بعضی از شاخه های الایزا استفاده میشود مانند رنگ امیزی برش های بافتی در ایمونوهیستوشیمی که محصولات غیر محلول ،ناحیه واکنش انتی ژن یا انتی بادی را آشکار میکند.

 

 

10

واکنش متوقف کننده

 ریاجنتهایی اضافه میشوند تا از واکنش انزیمی بیشتر در الایزا پیشگیری شود.این کار در زمانی که خاص یک سنجش معین است انجام میشود.این فرایند معمولا متوقف کردن نامیده و ریاجنت مورد استفاده، متوقف کننده نامیده میشود.متوقف کردن معمولا زمانی انجام می شود که رابطه بین انزیم – سوبسترا –محصول در فاز خطی است .غلظتهای مولی اسیدهای قوی یا بازهای قوی فعالیتهای انزیم رابا دناتوره کردن سریع انزیم ها متوقف می کند.دیگر انواع ریاجنتهای متوقف کننده خاص انزیمها هستند.سدیم ازاید یک مهار کننده قوی HRP است در حالی که EDTA با چلاته کردن یونهای فلزی با نقش کوفاکتور، سبب مهارAP می شود.

از آنجایی که اضافه کردن عامل متوقف کننده ممکن است طیف جذبی محصول را تغییر دهد قله طیف جذبی باید مشخص شود.برای مثال OPD/ELISA با سولفوریک اسید متوقف می شود و در nm492 (450nm قبل از متوقف کردن)خوانده میشود.جدول 5 طول موجهای خوانش سوبستراهای مناسب را قبل  و بعد از اضافه کردن عامل متوقف کننده نشان میدهد.اضافه کردن عامل متوقف کننده می تواند حساسیت الایزا را افزایش دهد.در اضافه کردن ریاجنت متوقف کننده حجم ها باید صحیح باشند چرا که خوانش فتومتریک در صورت تغییر حجم کلی واکنشگرها تحت تاثیر قرار میگیرد.

 

11

خوانش

از آنجایی که با کاتالیز سوبسترا رنگ ایجاد میشود می توان آنرا به دو شیوه خواند  1. با بررسی چشمی یا 2. با اسپکتروفتومتر

 

11.1

خوانش با چشم

الایزا را می توان طوری طراحی کرد که با وجود شرایط مختلف و کنترلها در طراحی سنجش ،خوانش با چشم یا با اسپکتروفتومتر انجام شود. قبل از طراحی هر سیستمی اصول الایزا باید کاملا درک شود.در ازمایش های خاصی که نتایج با چشم خوانده میشوند استاندارد سازی کار ساده ای نمی باشد.با این حال وقتی که استاندارد سازی درستی بکار رود سنجش های حساسی طراحی میشود.وقتی که یک الگوی کامل پلیت استفاده میشود طیف رنگ از کامل تا رنگ جزیی و بدون رنگ را شاهد خواهیم بود.

مشخص است که نمونه های قوی مثبت رنگهای قوی می دهند ،مثبتهای ضعیف رنگی جزیی میدهند و منفی ها هیچ رنگی نمیدهند یا چاهکهای منفی هم همینطور.کنترل های از این دست باید در سنجش های مورد نظر گنجانده شوند. افتراق مثبتهای ضعیف از منفی ها در روش خوانش چشمی مشکل است.تفسیر ازمایشها با چشم از یک کاربر تا کاربر دیگر فرق میکند و به این ترتیب نتایج بیشتر بحث بر انگیز میشوند تا موقعی که از اسپکتروفتومتر استفاده میشود .دربعضی ترکیبات سوبسترا/انزیم خوانش با چشم مطلوبتر میشود.در مواردی که ازمایشها باید با چشم خوانده شود (مواقعی که دستگاه در دسترس نیست)باید سنجش های خوبی درازمایشگاههای دیگر  که ریاجنتها درآن با استفاده از دستگاههای خوانش تعیین مقدار میشوند تولید و پارامترها با خوانش چشمی ارزش گذاری شوند.به عنوان مثال جمعیتی منفی از سرم ها را می توان ازمایش کرد و سرم های منفی که انعکاس دهنده قسمتهای مختلف توزیع od منفی است را می توان به عنوان کنترل چشمی تعریف کرد.بنابراین یک سرم که دارای مقدارod بالاتری است میتوان به عنوان کنترل منفی انتخاب کرد.بنابراین هر سرمی که نتایج قابل تشخیص چشمی بالاتر از این سرم بدهد با اعتماد بالا به عنوان یک مثبت ارزیابی می شود.سنجش هایی که نیازمند مقایسه داده های بسیار نزدیک به هم است مثلا سنجش های رقابتی ، برای تفسیر با چشم مناسب نیستند مثلا در مواقعی که شیب رقابت مقایسه میشود.

 

11.2

خوانش با اسپکتروفتومتر

محصول کاتالیز سوبسترا با انزیم توسط نور عبوری از محصول و اندازه گیری مقدار جذب آن نور با یک دستگاه ،اندازه گیری می شود.چون محصولات رنگی مختلفی در الایزا تولید میشود باید دقت شود که فیلترهای مناسب برای تشخیص طول موجهای صحیح انتخاب شود .اگرچه میکروکووت ها و اسپکتروفتومترهای مرسوم برای این منظور استفاده می شوند اما در مواردی که شمار نمونه ها زیاد است ، کار پرزحمتی خواهد بود.ماشین ها ی خاصی برای خوانش محصولات رنگی در میکروپلیت ها وجود دارد.این ها جذب هر چاهک را در یک طول موج از پیش تعیین شده می خوانند.یا یک چاهک در یک زمان خوانده می شود (خوانشگر های دستی) یا یک ستون از هشت چاهک به طور همزمان خوانده میشوند(اسپکتروفتومترهای نیمه اتوماتیک یا تمام اتوماتیک).

 

در خوانشگرهای نیمه اتوماتیک فیلتر طول موج ها به صورت دستی اضافه میشود در حالی که برای خوانشگر های اتوماتیک فیلتر(ها) طول موجها به شکل فیلتر داخلی تعبیه شده است و از یک پنل کنترلی  انتخاب میشوند.بطور کلی نتایج چنین دستگاه هایی بصورت واحد جذب بیان میشود و روی یک کاغذ ثبت می گردند و یا اینکه به یک کامپیوتر وصل میشوند.شیوه های مختلفی (محدود اما کاربردی) از پردازش داده ها معمولا وجود دارد مانند بیان مقادیر یک جذب بصورت ماتریکس یا به صورت به اضافه یا منها علیه چاهکهای کنترل یا علیه مقادیری که به ماشین داده شده است.بیشتر خوانشگرها به کامپیوتر متصل میشوند و یک سری نرم افزار (تجاری یا خصوصی) در دسترس هست تا بتوان داده ها را دستکاری و ذخیره کرد.این  در موارد کار با نمونه های زیاد ویا در اعمال پیچیده ریاضی که روی داده ها انجام میشود، بسیار مهم است. ویژگی مهم الایزایی که محصول رنگی دارد و می توان با چشم ارزیابی کرد این است که می توان قبل از خوانش ماشین آن را بررسی کرد،مثلا در یک نگاه میتوان فهمید که ایا یک ازمایش کار کرده است یا خیر.بنابراین اگر یک اشتباه ناشی از عدم  دقت رخ داده باشد زمان بیش از حد برای خوانش صرف نمی شود برخلاف رادیوایمونواسی که در آن خوانش نمونه ها باید قبل از کسب نتایج انجام شود.چنین ارزیابی های چشمی در هنگام طراحی آزمایش ها که قرار است  دیدی از ازمایش گرفته شود  بسیار کاربردی و راحت است.

 

12

مشکلات عملی

این بخش مشکلات جنبه های عملی الایزا را که در شرایط ازمایشگاههای مختلف مشاهده میشود را به بحث میگیرد.

12.1

مشاهده کلی هنگام انجام الایزا

در عمده مشکلات انجام الایزا محققین هم دخیل هستند. چون من در اموزش و تامین ریاجنتهای کیت به ازمایشگاههای سراسر جهان دخیل بوده ام این موضوع برایم ثابت شده است.عمده مشکل نبود تماس نزدیک برای اموزش الایزا هست تا اشنایان با الایزا قدرت شناسایی و حل مشکلات در استفاده از ریاجنتها را داشته باشند.هیچ جایگزینی برای اموزش خوب ، نیست.

12.1.1

مشکلات ناشی از نبود دانش علمی

همانطور که در فصل 1 مشخص شده است ،تفسیرهای بیولوژیکی بدون داشتن دانش در چند زمینه علمی مانند اپیدمیولوژی ،ایمونوشیمی،بیوشیمی،و ایمونولوژی قابل ارزیابی نیست

 

12.1.2

مشکلات ناشی از تکنیکهای کم دقت

تکرار پذیری هر سنجشی تا قسمتی متکی بر صحیح کار کردن محقیقینی است که دخیل هستند.پیچیدگی این مساله هنگامی است که کاربران متعددی سنجش را انجام میدهند(مانند ازمایشگاه هاییکه تعداد زیادی سرم را بصورت معمول ازمایش میکنند). ارزیابی های فردی به منظور اطمینان از تکنیکها (مانند پی پت کردن و زمان بندی صحیح) بایدانجام شود.دستورالعمل های کنترل کیفی و تضمین کیفیت که در فصل 9 بحث شده باید تدوین شود.

 

12.1.3

مشکلات معمول تجهیزات و ریاجنتها

تمام مشکلات رانمی توان به عهده کاربران انداخت.اگرچه هر یک از مراحل الایزا نسبتا ساده است اما این سنجش ها از منظر دیگر که مراحل مختلف با ریاجنتهای مختلف ( تمام آنها باید استاندارد شوند)باید انجام شوند، میتواند پیچیده باشد.این امر احتمال مشکلات در روش انجام را افزایش میدهد.ریاجنتها باید ذخیره شوند بنابراین در معرض آلوده شدن با میکروارگانیزم ها هستند و یا ممکن است ریاجنتها ی ناخواسته از طریق استفاده از نوک های پی پت الوده توسط دیگر کاربران وارد شود. تعجب آوراست که یک خطای معمول ،خوانش چاهک ها در طول موج اشتباه است .کاربران باید علاوه براینکه od را میخوانند خوانش رنگ با چشم را هم یاد بگیرند.درمواردیکه کاربران هرگز الایزا ندیده اند باید از این مورد بگذریم ، وقتی یک پلیت رنگ کاهشی نشان میدهد خوانش OD باید طیفی از مقادیر برای هر سوبسترایی در حدود 1 واحد OD را نشان بدهد.اگر پلیت ها با چشم یک رنگ قوی تا متوسط را نشان میدهند اما خوانش OD ها پایین است (0.1 تا 0.3 حداکثر)آنگاه باید طول موج بررسی شود.اشتباه در مورد فیلتر می تواند در نتیجه کاربران دیگر باشدکه فیلترها را جاگذاری میکنند علاوه براینکه نمی دانند جایگاه یک فیلتر با طول موج ویژه در کجا قرار دارد.اغلب برنامه های نرم افزاری نیز یک طول موجی را نشان میدهند که در دستگاه تعریف نشده اما تنها طول موجی است که باید خوانش ازمایش درآن انجام شود.

12.1.4

آب

آب مشکل عمده در استاندارد سازی سنجش ها بین ازمایشگاههای مختلف است حتی وقتی که ریاجنتها یکسان باشد.بنابراین در بعضی از کیتها حداقل برای رقت سازی اولیه ریاجنتها آب تامین میشود .دلایلی که چرا آب الایزا را تحت تاثیر قرار میدهد بطور گسترده بررسی نشده است و هیچ عامل یکتای مهمی هم  بیان نشده است. خوب است که از آب سه بار تقطیر استفاده شود اما در ازمایشگاههای کمتر تجهیز شده همیشه در دسترس نیست.نوعی از مشکل این است که خوانش بالاتر از مورد انتظار در سرم کنترل و بلانک پلیت پیش می اید. تامین آب برای تهیه بافرها و رقت دادن اولیه ریاجنتها این مساله را حل میکند.کاربران باید اطلاعاتی ازمایشگاههای دیگر کسب کنند  که آیا آنها مشکلات مشاهده شده را حل کرده اند.

12.1.5

شیشه الات ازمایشگاهی

شیشه آلات ازمایشگاهی باید تمیز باشند و با آب مقطر مخصوص خوب شسته شوند.اینکار از ورود الاینده ها یا تغییر pH در ریاجنتهای الایزا ، به ویژه هنگام رقیق کردن اولیه کنژوگه ، پیش گیری میکند. اگر شستشوی کافی انجام نشود استفاده از اسیدها می تواند مشکلاتی چون تخریب انزیم ها را سبب میشود.

 

12.1.6

نوک های میکروپی پت

نوکهای میکروپی پت گران هستند ودر ازمایشگاهها به مقدار کم تهیه میشوند.آنها را میتوان شست اما مراحل ذیل باید انجام شود.

1. هرگز نوکهایی که برای کنژوگه یا محلول کنژوگه استفاده شده اند دوباره استفاده نکنید
2. بررسی کنید که انتهای نوک ها طی استفاده یا شستشو اسیب ندیده اند.
3. همیشه نوک ها را در آب مقطر خوب شستشو دهید
4. نوک ها را قبل از استفاده خشک نمایید
5. نوک های مناسبی را که با میکروپی پت ها جور میشوند بگیرید.جور نشدن درست سبب مشکلاتی در پی پت کردن و منجر به عدم صحت می شود.

5.12.1.7

میکروپی پتها

از آنجایی که میکروپی پت ها تجهیزاتی هستند ک حجم هایی از مایع را تخلیه میکنند اساسا در صحت الایزا مهم هستند. باید از نظر دقت و صحت حجم های تخلیه شده بطور منظم بررسی شوند.دستورالعمل چگونگی این کار معمولا همراه پی پتها وجود دارد درغیر اینصورت از سازنده بخواهید که این کار را چگونه باید انجام داد.نگه داری دقیق پی پتها با توجه به پیستون های پی پتهای چند کاناله که در معرض الودگی هستند باید انجام شود.اطمینان یابید که مایعات به داخل پی پت کشیده نمی شود در این صورت باید تمیز شوند.خوردگی زمانی اتفاق می افتد که مثلا ریاجنت متوقف کننده سولفوریک اسید به داخل بدنه پی پت کشیده میشود.

12.1.8

پلیت ها

1. اگر پلیت ویژه ای توصیه شده است پس همان پلیت را استفاده کنید مگر اینکه مجبور باشید ریاجنت مفروض را دریک پلیت دیگر دوباره تیتر کنید.
2. هرگز یک پلیت با درجه کشت بافت را در الایزا استفاده نکنید.گاهی اوقات این پلیت ها کار میکنند اما نسبت به آنهایی که اختصاصا برای الایزا ساخته شده اند تغییرات زیادتری نشان میدهند.
3. همیشه گزارش دهید که کدام پلیت و کدام تیمار روی پلیت انجام شده است.
4. استفاده مجدد از پلیت ها بعد از شستشو مشکل ساز است و تغییرات زیادی مشاهده شده است.با این حال اگر دلایل اقتصادی و تامینی مد نظر است لازم است بعد از شستشوی پلیت ها در شیرآب از NaOH 2 مولار در تمام طول شب استفاده کنید و آنگاه درآب مقطر کاملا آب کشی نمایید. پلیت های شسته شده را با کنترل های بیشتری نسبت به پلیت های جدید استفاده کنید تا تغییرات و نوسانات را اندازه بگیرید.

12.1.94.

مخزن ها 

1.مخزنهای اختصاصی راتنها برای کنژوگه و سوبسترا استفاده کنید تا ازالودگی متقاطع جلوگیری شود

2. بعد از استفاده، مخازن را درآب شیر بشویید و بدنبال آن با آب مقطر و آنگاه آنرا در یک دترجنت ملایم بخیسانید.برای استفاده ،با آب شیر بعد با آب مقطر بشویید وآنگاه با حوله خشک کنید.

1. هرگز ریاجنتها را برای مدت طولانی در مخازنی که برای سنجش استفاده شده است باقی نگذارید، اگر ممکن است فورا بشویید.

 

12.1.10

محلول سوبسترا

دمای محلول سوبسترا مهم است چون بر سرعت واکنش تشکیل رنگ اثر میگذارد.بنابراین سعی کنید تا اضافه کردن سوبسترا را همیشه در دمای یکسان انجام دهید.این کار به راحتی با استفاده از قرص های بافر و یا نگه داری آب مورد استفاده در دمای ثابت و یا با از پیش اینکوبه کردن سوبسترا در حمام آب حاصل میشود.وقتی محلول سوبسترا بصورت منجمد نگه داری می شود باید مطمئن شوید که پس از ذوب کردن ایا به همان دمای مورد نظر ازمایش رسیده است (اگرنه دوباره با استفاده از حمام اب به دما برسانید).یک محدوده بین 20 تا 30 درجه سانتی گراد توصیه میشود.تغییرات در دمای محلول سوبسترا بزرگترین عامل به وجود امدن اختلاف بین سنجش های انحام شده با ریاجنتهای یکسان میباشد.

 

12.1.11

زمان مراحل

بطور کلی هر یک از مراحل باید به درستی زمان بندی شود بنابراین برای یک مرحله اینکوباسیون 1 ساعتی ، بیش از 5 دقیقه خطا قابل تحمل نیست.برای سنجش هایی که زمان های خاصی را توصیه میکنند هیچ دلیلی وجود ندارد که رعایت نشود .وقتی که پلیت ها می چرخند زمان بندی کمتر اهمیت دارد اگر چه کار خوبی است که دستورالعمل را به درستی رعایت شود.

 

12.1.12

اینکوباسیون

ما پلیت های ساکن را درمقایسه با پلیت های چرخان بررسی کردیم.نتیجه گیری این است که چرخاندن پلیت ها طی مراحل اینکوباسیون بسیار توصیه میشود تا اثرات ویسکوزیتی ،اختلافات زمان ،واختلافات دما شامل اختلافات لبه چاهک را وقتی که روی هم بصورت طبقه  و بطور ساکن اینکوبه شده اند را برطرف کنیم.با این حال وقتی روتاتور موجود نیست استاندارد سازی روش ها لازم است و سنجش های مبتنی بر پلیت ساکن مشکل به حساب نمی اید. وقتی که پلیت ها چرخانده نمیشوند، نکات زیر کمک کننده خواهد بود.

1. پلیت ها را بصورت طبقه قرار ندهید، آنها را بصورت جداگانه نگه دارید.
2. در 37 درجه اینکوبه کنید
3. همیشه روش یکسانی را در اضافه کردن ریاجنتها بکار ببرید ،یعنی یک پلیت را یکبار و دیگری را سه بار نتکانید یا اینکه یک یا دو پلیت را طی اینکوباسیون بررسی کنید و در مورد بقیه اینکار را انجام ندهید.با استفاده از روشهای مختلف ریاجنتها در فاز جامد با درجات مختلفی مخلوط میشوند و به این وسیله برهم کنش در این چاهک ها تغییر میکند.بنابراین در برخورد با پلیت ها دریک ازمایش و از این روز تا روز دیگر یکسان عمل نمایید.
4. اگر اینکوباسیون لازم است در دمای اتاق انجام شود به دما توجه کنید وتغییرات دما در طول سال را در نظر داشته باشید.این مساله تغییرات نتایج را در زمان های مختلف توضیح می دهد.

 

12.1.13

کنژوگه ها

 در مورد کنژوگه ها دقت کنید چون تامین کننده سیگنال کل سنجش هستند.

1. مطمین شوید که می دانید کنژوگه چیست(از چه گونه ای ساخته شده، فعالیت اختصاصی انتی بادی و غیره )
2. در دمای توصیه شده ذخیره کنید
3. هرگز کنژوگه رقیق شده را برای استفاده در زمان دیگر ذخیره نکنید
4. همیشه رقت کاری کنژوگه را درست قبل از نیاز درست کنید
5. همیشه از نوک های تمیز و ترجیحا استفاده نشده برای توزیع کنژوگه ها استفاده نمایید.
6. اگر رقت توصیه شده یا رقت تیتر شده از کنژوگه بسیار بالا است (مانند 10000/1) 1 میکرولیتر را به 10 میلی لیتر اضافه کنید تا رقت کاری ساخته شود . ممکن است درساخت حجم های کم از رقت کاری مشکل داشته باشید.بنابراین باید یک رقت کم تهیه کنید تا امکان پی پت کردن کنژوگه بدون ضایعات را داشته باشید.در 50%گلیسرول/50%pbs رقیق کنید تا یک رقت 10/1 از اصلی داشته باشید ، اگر ممکن است در -20c نگه داری کنید.
7. هرگز کنژوگه ها را برای مدتی طولانی روی میز رها نکنید
8. ترجیحا گلیسرول استریل (با ححم برابر)برای کنژوگه هایی که در -20 درجه ذخیره میشوند اضافه کنید.

 

12.1.14

اضافه کردن محلول متوقف کننده

از آنجایی که اسپکتروفتومتر چندکاناله از طریق قطر مایع خوانش را انجام میدهد هر تغییری در حجم یک چاهک منجر به تغییر در OD برای همان محلول رنگی میشود.بنابراین مهم است که محلول متوقف کننده را به درستی اضافه کنید تا به حجم یکسانی درهر چاهک برسید و اثر تغییر حجم را محدود کنید ( البته این در مورد محلول کنژوگه نیز صدق میکند و به خشک کردن پلیتها نیز توجه کنید تا محلول شستشوی باقی مانده را برطرف کنید همه آنها حجم نهایی در یک چاهک را تحت تاثیر قرار میدهند).

12.1.15

اضافه کردن نمونه ها

 تکنیک صحیح و یکسان برای محدود کردن خطای پی پت کردن ضروری است.مشکلات عمده ای بر اثر عوامل زیر ایجاد میشود.

1. خطا در قرار دادن نمونه در داخل بافر درون چاهک و باقی گذاردن آن روی جدار پلیت (به ویژه وقتی که پلیتها بصورت ساکن اینکوبه میشوند).
2. کف کردن هنگام اضافه کردن نمونه ها
3. فقدان تمرکز هنگام اضافه کردن تعداد زیادی نمونه که سبب از دست رفتن بعضی از چاهکها و دوبار ریختن نمونه ها در یک چاهک می شود.
4. پی پت ها و نوکهای درست نگه داری نشده
5. درست ذوب نکردن سرم ها (پروتیین ها تمایل دارند که در هنگام فریز کردن در ته لوله ها جمع شوند)بنابراین مخلوط کردن کافی برای اطمینان از هموژن بودن آنها ضروری است.

 

5.12.1.16

خوانش پلیت ها / داده ها

مزیت الایزا این است که پلیت ها را می توان به سرعت خواند و مقدار زیادی داده ایجاد کرد اما  منجر به چند مشکل میشود.

 

1. نتایج کامپیوتری که از داده های پلیت پردازش شده حاصل میشود باید به سرعت به وسیله چشم نیز بررسی شوند.این کار لازم است چون بعضی از برنامه ها درمورد نتایج بسیا ر مشکوک که توسط خطای نمونه گذاری عمده ایجاد شده، هشدار نمی دهند. میانگین داده های پلیت توسط کامپیوتر محاسبه میشود و از این داده ها برای نسبت دادن مثبت و منفی به نمونه های ویژه میتوانید استفاده کنید.در صورت نبود ویژگی های هشداردهنده نرم افزاری در غربال مقادیردوتایی OD بسیار متفاوت ، نتایج کاذب ممکن است بدست آید(مانند دو مقدار برای یک سرم 0.40 و 0.42 است که میانگین برابر با 0.41 و مثبت است . دو مقدار برای سرم دیگر 0.02 و 0.74 است که میانگین برابر است با 0.41 ؟) .بررسی اولیه داده ها توسط فرد به راحتی نتیجه این سرم را بی معنی تشخیص میدهد در حالی که تنها با ارجاع به چاپ کامپیوتری مثبت /منفی ، تشخیص داده نمی شود.این یک مثال ساده است اما برنامه های تحلیلی پیچیده تر مشکلات مخفی مشابه دارند.
2. یک پایگاه بزرگ داده برای ذخیره داده ها از غربالگری در مقیاس بزرگ ،ایجاد میشود.در این روند نتایج به عنوان داد ه هایی قابل اعتماد مستقیما به داخل پایگاه داده ها برده میشوند بدون اینکه با چشم بررسی شوند .محققین اغلب دوست دارند که نتایجی از چندین ازمایشگاه داشته باشند و بنابراین برنامه هایی تامین شده است که این نیاز را آسان میکند.چنین برنامه هایی می تواند به راحتی فرایند تشخیص را با کنترل نتایج و رد بررسی مجدد داده ها از دست انسان بگیرد.
3. کابلهایی که کامپیوترها را به اسپکتروفتومترها و چاپگرها متصل میکند ممکن است کار نکنند .این ها مشکلات سخت افزاری عمومی هستند که باید با آنها مقابله کرد.

 

12.2

مشکل یابی الایزا

جدول 6 بعضی ازمشکلاتی را که معمولا در طراحی الایزا و در عمل دیده میشوند نشان میدهد و مواردی را که در صورت مواجهه با مشکل اول باید بررسی شوند برجسته ساخته است.

 

 

 

 

john R. Crowther, Methods in molecular biology, The Elisa Guidebook, Second Edition, 2009, Vol. 516