اسپکترومتری جرمی (mass spectrometry)
فصل 14
اسپکترومتری جرمی (mass spectrometry)
اسپکترومتری جرمی (mass spectrometry = MS) یک تکنیک انالیزی کیفی و کمی توانمند است که برای اندازه گیری گستره بزرگی از انالیت های بالینی استفاده میشود.هنگامی که اسپکترومتری جرمی با کروماتوگراف های گاز یا مایع جفت شود انالایزرهای حاصل توانایی انالیزی گسترده تر با کاربردهای بالینی بیشتری خواهند داشت. از انجایی که توانایی اسپکترومتری جرمی در شناسایی و اندازه گیری پروتیین ها انرا به به یک ابزار انالیزی کلیدی تبدیل کرده است که از ان میتوان در حوزه نوپدید پروتئومیکس (proteomics) استفاده کرد.
ما این فصل را با بحث روی مفاهیم پایه و تعریف اسپکترومتری جرمی شروع میکنیم و سپس دستگاهی کردن و کاربردهای بالینی انرا دنبال میکنیم.این فصل به تنهایی نمی تواند همه مفاهیم تکنیک اسپکترومتری جرمی را پوشش دهد حتی اگر فقط روی کاربردهای بالینی ان تمرکر شود.
مفاهیم پایه و تعریف ها (basic concepts and definitions)
اسپکترومتری جرمی شاخه ای از علم است که به همه جنبه های اسپکترومترهای جرمی و نتایج به دست امده از انها می پردازد.جرم مولکولی (که به ان گاهی وزن مولکولی گفته میشود) به صورت واحد جرم اتمی یکپارچه شده سنجیده میشود که التبه بصورت دالتون (Dalton=Da) نیز شناخته میشود.جرم اتم کربن در حالت انرژی کمینه اش بصورت 12 Daتعریف میشو.اگرچه واژه واحد جرم اتمی (atomic mass unit=amu) هم ارز با Da در نظر گرفته شده است اما فقط ان تقریبا برابر با Da است و اکنون به عنوان یک واحد کم کاربرد در نظر گرفته میشود. اسپکترومتر جرمی یک دستگاه اندازه گیری است که ابتدا مولکول هدف را یونیزه میکند و سپس جداکرده و جرم مولکول یا جرم قطعات انرا اندازه میگیرد.انالیز جرمی فرایندی است که به وسیله ان یک یا چند گونه یونی بر طبق نسبت جرم به بار (mass-to-charge ratio = m/z) شناسایی میشوند.انالیز کیفی ،کمی و بی نهایت مفید در تعیین عنصرهای شکل دهنده و ساختار هم ترکیبات الی و هم غیر الی است.تمام تکنیکهای اسپکترومتری جرمی نیازمند یک گام یونیزاسیون هستند طوری که یک یون از یک اتم یا مولکول خنثی به وجود اید.در حقیقت توسعه تکنیک های یونیزاسیون همه کاره سبب شده که اسپکترومتری جرمی یک ابزار انالیزی بسیار عالی چنانکه اکنون است شود.در سال 2002 john fenn و koichi tanaka جایزه نوبل را به ترتیب بخاطر طراحی الکترواسپری (electrospray) و laser desorption ionization باهم دریافت کردند.
یون ها ممکن است تکه تکه شدن (fragmentation) در یک اسپکترومتر جرمی را متحمل شوند.یک یون تکه نشده (unfragmented ion) از مولکول اصلی را یون مولکولی (molecular ion) میگویند.اگر منبع یونیزاسیون نرم (soft) باشد به این معناست که تکه های کوچکی تولید میکند ،فراوانترین پیک ها در طیف جرمی (پیک پایه ) ممکن است یون مولکولی باشد.یونهایی که به وسیله فرگمنتاسیون از یک یون مولکولی در منبع یون ایجاد میشوند یونهای فرگمنت (fragment ions) نامیده میشوند.اگر منبع یون سخت (hard) باشد به این معناست که فرگمنتاسیون گسترده ای ایجاد میکند و پیک پایه ممکن است یکی از یونهای فرگمنت باشد.طبق قرارداد پیک پایه در یک طیف جرمی بصورت فراوانی نسبی از 100% بیان میشود.
یونهای فرگمنت که در یک سلول جداسازی مجزا در یک اسپکترومتری جرمی پی در پی شکل میگیرند یه انها یونهای محصول (product ions) گفته میشود.یک اسپکترومتر جرمی تاندم (پی در پی ) از دو اسپکترومتر جرمی تشکیل شده که پی در پی عمل میکنند و یا یک اسپکترومتر جرمی که توانایی اندازه گیری پی در پی یونها را داراست .بطور کلی یونها بین دو مرحله انالیز m/z به یونهای محصول شکافته میشوند.
یک طیف جرمی به وسیله فراوانی نسبی هر یون به عنوان یک تابعی از نسبت m/z ان رسم میشود (شکل 14-1)
معمولا هر یون یک بار تک (z=1) دارد بنابراین نسبت m/z برابر با جرم میشود .با این حال در برخی موارد بار ممکن است با جند شماره دیگر نمایش داده شود که در این مورد نسبت m/z برابر با جرم نخواهد بود بلکه کسری از جرم خواهد بود.
پایش یونهایی با جرم بالاتر معمولا منجر به پایین امدن حد تشخیص میشود چون یونهای پس زمینه کمتری وجود دارد.یک پیک در یک طیف جرمی را میتوان به وسیله تفکیک (resolution) ان ، (m/z)/(Δm/z) مشخص کرد که Δm/z پهنای پیک طیفی جرم (width of mass spectral peak) .این پارامتر توانایی یک اسپکترومتر جرمی را در جداسازی جرم های نزدیک به هم از یکدیگر را نشان میدهد.
با قراردادن فراوانی نسبی پیک پایه به 100% و استفاده از فراوانی نسبی هر یون فرگمنت بجای مقدار مطلق ان تغییرهای وابسته به دستگاه به کمترین مقدار میرسد و این طیف جرمی با طیفهای بدست امده در دیگر دستگاه ها قابل مقایسه خواهد بود.از انجایی که فرگمنتاسیون در باندهای خاص بستگی به ماهیت شیمیایی انالیت دارد بنابراین طیف جرمی را میتوان بعنوان ساختار مولکولی انالیت تفسیر کرد.در برخی موارد ساختار شیمیایی انالیت را میتوان دریافت و یا دست کم با ویژگی های بدست امده از طیف جرمی سازگار کرد.کتابخانه ای بر پایه کامپیوتر از طیف ها نیز برای کمک در شناسایی انالیت (ها) وجود دارد.در برخی کاربردها طیف جرمی یک انالیت ممکن است در برابر طیفهای جرمی در یک پایگاه داده همخوانی داده شود و به این وسیله انالیت را با اثر انگشت طیف جرمی ان شناسایی کرد.
هنگامی که یک اسپکترومتر جرمی به یک کروماتوگرافت مایع یا گاز می پیوندد انگاه به عنوان یک اشکارساز توانمند عمل میکند که میتواند اطلاعات ساختاری را در زمان واقعی و برای هر انالیت تک ،همینطور که از ستون کروماتوگرافی بیرون میاید ،فراهم نماید.بسته به ویژگی های عملکردی اسپکترومتر جرمی و پهنای پیک کروماتوگرافی چندین اسکن طیفی جرم در سراسر پیک میتوان داشت.جمع همه یونهای ایجاد شده بصورت تابعی از زمان نمایش داده میشود و یک کروماتوگرام یون کلی را به دست میدهد.
اسپکترومتر جرمی به عنوان یک اشکارساز جهانی شناخته میشود چون تمام ترکیب ها دارای جرم هستند.سیستم داده را میتوان طوری گزینش کرد که تنها کروماتوگرام های یک یون از پیش انتخاب شده را هنگام داده گیری نشان دهد.نمایش حاصل را کروماتوگرام یون استخراج شده مینامند و گاهی به عنوان پروفایل یون استخراج شده .هر دوی این نمایش ها نمایی از یک کروماتوگرام با شدت سیگنال رسم شده به عنوان تابعی از زمان را دارا هستند.زمان نگه داشت (retention time) را میتوان اندازه گرفت و ارتفاع های پیک یا سطح زیر پیک را میتوان برای استفاده در انالیزهای کمی بکار گرفت.
اماده سازی نمونه در یک اسپکترومتری جرمی موفق بسیار حیاتی است به ویژه هنگامی که با ماتریکس های پیچیده رو به رو هستیم مانند انچه که در شیمی بالینی رخ میدهد.این کار شامل یک یا چند گام است 1) رسوب پروتیین (protein precipitation) 2) استخراج فاز جامد (solid-phase extraction) 3) استخراج مایع-مایع (liquid-liquid extraction) 4) مشتق سازی (derivatization). مشتق سازی یک فرایند اصلاح شیمیایی ترکیب (های) هدف است به بسیار بهتر به وسیله اسپکترومتری جرمی انالیز شوند.معمولا مشتق سازی شامل افزودن برخی گروه های عملکردی شناخته شده هستند.هدف های مشتق سازی بسته به کاربرد با هم فرق دارند اما شامل یک یا چندین مورد است 1) افزایش سرعت تبخیر 2) پایداری گرمایی بالاتر 3) تغییر ویژگی های کروماتوگرافی 4) کارایی بالا در یونیزه شوندگی یا 5) ویژگی های فرگمنتاسیون بهتر.
هنگامی که انالیت های کمی برای انالیز کمی مد نظر است و طیف جرمی انها نیز معلوم است ،اسپکترومتر جرمی را میتوان برای پایش تنها همان یونها برنامه ریزی کرد.این تکنیک تشخیص گزینشی را پایش یون گزینش شده (selected ion monitoring=SIM) مینامند.از انجایی که SIM بر شمار کمی از یونها تمرکز میکند سیگنال های یونی بیشتری برای هر m/z گرداوری میشود.این نسبت سیگنال به نویز (signal to noise ratio) انالیت را افرایش میدهد و حد شناسایی را پایین تر میاورد.بطور کلی یک ترکیب ناشناخته هنگامی به عنوان ترکیب شناخته شده قلمداد میشود که فراوانی های نسبی سه یا چهار یون در محدوده ±20% مقدارهای مربوط به ترکیب رفرانس باشد.
یک عنصر شیمیایی ممکن است از یک ایزوتوپ تک یا چندین ایزوتوپ تشکیل شده باشد.ایزوتوپ های یک عنصر شمار یکسانی از پروتون ها را در هسته خود دارند اما شمار نوترونهای انها متفاوت است.برای مثال کربنی که در طبیعت وجود دارد در اصل از دو ایزوتوپ تشکیل شده است .12C که هسته ان دارای 6 پروتون و 6 نوترون است و 13C که هسته ان دارای 6 پروتون و 7 نوترون است.برخی عنصرها مانند ارسنیک تنها یک ایزوتوپ تک در وضعیت موجود در طبیعت را دارند.
یک برتری اشکار اسپپکترومتر جرمی ان است که میتواند بگونه همزمان یک ترکیب با فراوانی طبیعی از ایزوتوپ را از یک انالوگ غنی شده از یک ایزوتوپ پایدار را افتراق داده و اندازه گیری نماید ] برای مثال 2H نسبت به 1H ، 13C نسبت به 12C ، 15N نسبت به 14N ، 18O نسبت به 16O [ .یک ترکیب نشاندار شده با ایزوتوپ پایدار به عنوان استاندارد درونی استفاده میشود چون طی اماده سازی نمونه و انالیز کروماتوگرافی تقریبا با ترکیب طبیعی یکسان عمل میکند.استاندارد درونی باید دارای چنان مقدار کافی از ایزوتوپ سنگین باشد طوری که هیچ ایزوتوپ موجود بطور طبیعی (مانند 2H یا 13C ) در جریان یونی اثر چشمگیری نداشته باشد.برای مشتق های متامفتامین که در شکل 14-2 نشان داده شده است یک استاندارد درونی با دست کم سه اتم 2H یا 13C بهتر است چون در این نقطه فراوانی طبیعی این ایزوتوپ ها تقریبا برابر با 0.1% در 3 واحد جرم بالای یون مولکولی ] (M+3)+ میباشد.جایگذاری اتم های ایزوتوپ پایدار در ساختار نیز مهم است.برای مثال m/z 204 ion برای متامفتامین نشانگر بخش الیفاتیک مولکول (از دست رفتن حلقه اروماتیک ) است.اگر پنج اتم دوتریوم در حلقه اروماتیک متامفتامین وجود داشتند ،مشتق های پنتافلوئوروپروپیونیل هم ماده طبیعی و هم ماده نشاندار با ایزوتوپ m/z 204 ion را ازاد میکردند.همینطور ،ایزوتوپ پایدار طوری جایگذاری شده باشد با مولکولهای حلال جایگزین نگردد.توانایی اندازه گیری یک ترکیب در رابطه با گونه های ایزوتوپ با غلظت معلوم یا ثابت را انالیز رقت ایزوتوپ (isotope dilution analysis) میگویند، و تکنیک اسپکترومتری جرمی خاص ان را به نام اسپکترومتری جرمی رقت ایزوتوپ (isotope dilution mass spectrometry = IDMS) میشناسند. تکنیک IDMS برای توسعه روشهای شناسایی شماری از انالیتهای بالینی شامل داروهای سوئ مصرف بکار برده شده است .
دستگاهی کردن (instrumentation)
یک اسپکترومتر جرمی تشکیل شده از 1) یک منبع یون 2) یک سیستم مکش 3) یک انالیزگر جرم 4) یک اشکارساز و 5) یک کامپیوتر (شکل 14-3).
منبع یون (ion source)
روشهای بسیاری بکار رفته تا یونها را هم تحت مکش بالا و هم در شرایط نزدیک به فشار جو ایجاد کنند.یونیزاسیون الکترونی (electron ionization=EI) و یونیزاسیون شیمیایی (chemical ionization=CI) تکنیک های یونیزاسیون بکار رفته در هنگامی است که مولکولها در فاز گاز بطور مستقیم از گاز کروماتوگراف وارد انالیزر میشوند.در دیگر انالیزها مانند کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا – اسپکترومتری جرمی (HPLC-MS) ، الکترواسپری یونیزاسیون (electrospray ionization=ESI) ،یونیزاسیون شیمیایی در فشار جو (atmospheric pressure chemical ionization=APCI) ،و فوتویونیزاسیون در فشار جو (atmospheric pressure photoionization=APPI) به عنوان منبع های یونیزاسیون با انالایزر مرتبط میشوند.دیگر تکنیک های یونیزاسیون شامل 1) inductively coupled plasma (ICP) 2) matrix assisted laser desorption ionization (MALDI) 3) atmospheric pressure matrix assisted laser desorption(AP-MALDI) و 4) و شماری منبع های کمتر شناخته شده دیگر .این فصل بحث خود را به منبع های یون مورد علاقه در انالیز شیمیایی بالینی محدود میکند.
یونیزاسیون الکترونی (electron ionization)
در یونیزاسیون الکترونی مولکولها در فاز گازی به وسیله الکترون های تابش شده از یک رشته گداخته بمباران شده و به یک الکترود جمع کننده جذب میشوند (شکل 14-4).
این فرایند باید در شرایط خلا رخ دهد تا از اکسیداسیون رشته پیگیری کند.یک اختلاف پتانسیل 70 eV الکترونهایی با انرژی کافی تولید میکند و برخورد نزدیک با بیشتر مولکولهای الی یک کاتیون رادیکالی ایجاد کرده که هم یون است و هم رادیکال . سپس یون رادیکال (radical ion) اغلب یک بازارایی درون مولکولی به خود میبیند و به یک کاتیون و یک رادیکال شکافته میشود.
یونهای مثبت به وسیله یک میدان الکتریکی از اتاق یونیزاسیون به بیرون یا رانده شده و یا کشیده میشوند.سپس کاتیون ها به طور الکتروستاتیکی متمرکز و به درون انالایزر جرم رانده میشوند.یونیزاسیون الکترونی در اصل به عنوان یک منبع یون در گاز کروماتوگرافی – اسپکترومتری جرمی استفاده میشود.با توجه به پایداری شیمیایی یونهای مولکولی، فراوانی نسبی یونهای مولکولی و یونهای فرگمنت که در یک منبع یونیزاسیون الکترونی تولید میشوند بطور منطقی تکرارپذیر می باشد.الگوی فرگمنتاسیون بیشتر به عنوان یک اثر انگشت برای شناسایی ترکیب ها به وسیله مقایسه کتابخانه طیف جرمی بکار گرفته میشود.
یونیزاسیون شیمیایی (chemical ionization)
یونیزاسیون شیمیایی یک تکنیک یونیزاسیون نرم است که در ان یک پروتون به وسیله مولکول گازی ریاجنت (reagent gas molecule) مانند متان ،امونیا ،ایزوبوتان و یا اب منتقل میشود به و یا جدا میشود از یک انالیت گازی شکل (gas-phase analyte) .گاز ریاجنت (reagent gas) به درون منبع یونیزاسیون شیمیایی ویژه سرازیر میشود و به دنبال ان فشار منبع در حدود 0.1 torr (torr برابر با mm Hg است و واژه ای است که در زمینه اسپکترومتری جرمی بسیار بکار برده میشود).یک پرتو الکترونی گونه های واکنش پذیر (مانند CH5+ برای متان) تولید میکند.از طریق یک سری واکنشهای یونی – مولکولی ،یونهای انالیت معمولا از طریق چسبیدن یک پروتون باردار میشوند.در بیشتر موارد فرگمنتاسیون نسبتا کمی رخ میدهد.یونیزاسیون شیمیایی به روش negative ion electron capture نیز وجود دارد و برای اندازه گیری داروهایی مانند بنزودیازپین ها بکار میرود.شکل گیری یونهای منفی هنگامی رخ میدهد که الکترونهای گرما دیده به وسیله یک جایگزین الکترونگاتیو مانند کلرین (chlorine) یا فلوئورین (fluorine) روی انالیت به دام میافتد.هرجایی که دارای کاربری باشد یونیزاسیون شیمیایی به روش یون منفی حد شناسایی بسیار پایینی داشته است.یونیزاسیون شیمیایی همچنین به عنوان یک منبع یونی در گاز کروماتوگرافی – اسپکترومتری جرمی (GC-MS) استفاده میشود .
یونیزاسیون به روش الکترواسپری (electrospray ionization)
یونیزاسیون الکترواسپری یک تکنیک یونیزاسیون نرم است که در ان یک نمونه قبل از وارد شدن به انالیزر جرمی در فشار جو یونیزه میشود. نمونه که معمولا یک برون دهی(effluent) از HPLC است از طریق یک لوله مویین فلزی یا سیلیکا (fused silica) باریک که به ان 3 – 5 kV ولتاژ اعمال شده است میگذرند (شکل 14-5 , A).جداسازی باری اندک بین مایع و لوله مویین منجر به ناپایداری در مایع میشود که ان نیز به نوبه خود منجر به پخش یکسری قطره های باردار در نوک لوله مویین میشود.یک گاز افشان کننده هم راستا که در بسیاری از منبع های یونیزاسیون الکترواسپری استفاده میشود کمک میکند تا قطره های باردار به سمت الکترود روبرو بروند.قطره ها همانطور که از طریق ناحیه فشار جوی میگذرند تبخیر میشوند و قطره های کوچکتر همانطور که نسبت بار به حجم انها از حد ناپایداری Raleigh میگذرد بیشتر پخش میشوند.مولکولی که با پروتون یا امونیوم افزوده شده ممکن است همراه با مولکولهای حلال باشد که حلال زدایی شده و یونهای تنها شکل میگیرند. با این حال گاهی دیگر محصول های یونیزاسیون ماننده یونهای فلزی افزوده شده به مولکولهای انالیت یا یونهای شکل گرفته به وسیله فرایندهای کاهش اکسایش نیز دیده میشوند.سپس یونها از طریق یک مخروط نمونه برداری و یک یا چند مخروط استخراج پیش از اینکه وارد ناحیه مکش بالای انالایزر جرمی شوند، میگذرند.
یک ویژگی نامعمول یونیزاسیون الکترواسپری تولید چندین یون باردار به ویژه از پپتیدها و پروتیین ها است.معمول است که تقریبا برای هر 10 رزیدیوی امینو اسید در یک پروتیین یک بار را می بینیم.برای مثال از انجایی که یک مولکول با جرم 20000 می تواند دارای 20 بار باشد بنابراین میتوان انرا در m/z 1000 (20000/20) یک توان جداسازی پایین تر و با یک انالایزر ارزانتر شناسایی کرد.این سبب میشود که بازه جرمی در دسترس چنین دستگاه هایی گسترش یابد.در این موارد یک سری پیک هایی دیده میشود که هر پیک مطابق با شمار متفاوتی از بارها است.پلیمرهای نوکلئیک اسید نیز میتوانند یونهای باردار گوناگون تولید کنند به ویژه هنگامی که طیفهای جرمی یونیزاسیون به روش الکترواسپری به روش یونی منفی به دست ایند.
باید یاداور شد که شکل 14-5 یک نمونه ساده شده از پروب است که به سمت مخروط سمپلینگ اشکارساز جرمی هدایت میشود.برای افزایش کارایی و کاهش الودگی اشکارساز جرمی ،پیکربندی های سخت افزاری مدرنی پروب و یا اشکارساز جرمی از مخروط سمپلینگ محافظت میکنند.
یونیزاسیون الکترواسپری میرود که یک منبع یون کارامد گردد برای ترکیب های قطبی یا برای ترکیبهایی که در محلول یونیزه میشوند،که درصد بالایی از ترکیبهای مورد علاقه از دیدگاه پزشکی از ان جمله هستند. یونیزاسیون الکترواسپری و یونیزاسیون شیمیایی در فشار جو (APCI) یک رابط کارامدی را بین کروماتوگراف مایع و اسپکترومتر جرمی ایجاد کرده اند.این ها پرکاربردترین منبع های یونی در اسپکترومتری جرمی بالینی شده اند.
یونیزاسیون شیمیایی در فشار جو (atmospheric pressure chemical ionization)
APCI همانند یونیزاسیون الکترواسپری است از ان جهت که یونیزاسیون در فشار جو رخ میدهد،شامل افشاندن (nebulization) و حلال زدایی است و از همان مخروطهای نمونه و استخراج استفاده میکند.تفاوت اصلی در روش یونیزاسیون است.در APCI هیچ ولتاژی در لوله مویین بکار برده نمیشود.بجای ان یک سوزن کرونا دیسچارج (corona discharge needle) استفاده میشود تا یک یونیزاسیون حاصل از یک میدان الکتریکی قوی ایجاد کند.تا اندازه ای همانند فرایندهایی که در یک منبع یونیزاسیون شیمیایی رخ میدهد، یون های ایجاد شده به وسیله کرونا دیسچارج واکنشهای یون – مولکولی مانند انچه در زیر امده را به خود می بینند.
از انجایی که مولکولهای حلال ایلوانت (eluent) (مانند اب ،متانول ) به میزان زیادی نسبت به انالیت ها در نمونه وجود دارند،در ابشار یون مولکولی غالبا زودتر یونیزه شده و سپس به عنوان ریاجنت گازی عمل میکنند و به روش دومی مولکولهای انالیت را یونیزه میکنند (شکل 14-5 ,B) .از انجایی که محصول های این واکنشهای دوم ممکن است دارای دسته هایی از مولکولهای حلال و انالیت باشد یک لوله انتقال گرما دیده یا یک جریان ناهمسو از یک گاز پرده (curtain gas) مانند نیتروژن بکار میرود تا یونها را دسته زدایی کند.همانند یونیزاسیون الکترواسپری ،APCI یک تکنیک یونیزاسیون نرم به شمار میرود که نسبتا فرگمنتاسیون کوچک تولید میکند.بنابراین در مقایسه با یونیزاسیون الکترونی، طیف جرمی ایجاد شده به وسیله APCI و دیگر تکنیک های یونیزاسیون نرم ، در شناسایی انالیت به وسیله انگشت نگاری طیفی جرم کمتر کارایی دارند.با این حال از انجایی که جریان یونی ،درون یک پیک طیفی جرم (و یا پیک های طیفی جرم نسبتا کمتر اگر پیک های ایزوتوپ در نظر گرفته شوند) متمرکز شده است،APCI و دیگر منبع های یون نرم با نیازهای اسپکترومتری جرمی پیاپی و ترکیب هر دو در اندازه گیری کمی بسیار سازگار میباشند.APCI و یونیزاسیون الکترواسپری بطور کلی در یک گستره ای از ترکیبهای همانند کاربردی هستند.با این حال APCI یک منبع یون کارامدتر نسبت به یونیزاسیون الکترواسپری برای ترکیبهای نسبتا غیر قطبی است.
فوتویونیزاسیون در فشار جو (atmospheric pressure photoionization=APPI)
فوتویونیزاسیون در فشار جو یک منبع یون نسبتا نوین و با بکارگیری کمتر در شیمی بالینی است که یک روش مکمل را برای ESI و APCI فراهم میکند.پیکربندی فیزیکی یک منبع APPI همانند APCI است اما یک جریان فوتونی فرابنفش بجای سوزن کرونا دیسچارج استفاده میشود تا یون ها را در فاز گازی ایجاد کند.در APPI یک ناخالصی (dopant) یونیزه شونده مانند تولوئن (toluene) یا استون (acetone) غالبا هم راستا با با نبولایزر تزریق میشود تا منبع یونی فراهم شود که بار یا پروتون را به انالیت انتقال میدهد و به این صورت اثربخشی یونیزاسیون انالیت افزایش پیدا میکند.APPI گستره همسانی در کاربری همانند APCI دارد اما اغلب برای ترکیبهای بسیار کم قطبی مانند بیشتر استروییدها کاراتر از APCI است.
پلاسمای جفت شده القایی (inductively coupled plasma=ICP)
همانند ESI ، APCI ، و APPI تکنیک ICP یک روش یونیزاسیون در فشار جو است.با این حال برخلاف بیشتر روشهای یونیزاسیون در فشار جو که نرم به شمار میروند ( به عبارت دیگر فرگمنتاسیون کمی تولید میکنند) ، ICP یک نهایت در یونیزاسیون سخت (hard) به شمار میرود که بطور طبیعی منجر به اتمیزه (atomization) شدن کامل نمونه در فرایند یونیزاسیون میشود.در نتیجه کاربرد اصلی ان در انالیز عنصری (elemental analysis) است.در شیمی بالینی به ویژه در انالیز فلزهای کمیاب و فلزهای سنگین در بافت یا مایع های بدن بسیار مفید است.ICP بسیار حساس است (یک بخش در هزارمیلیارد = parts per trillion) و دارای گستره دینامیکی بسیار بالا .
به دنبال اماده سازی نمونه که معمولا شامل افزودن یک استاندارد داخلی مانند Yttrium و گاهی شامل یک گام تجزیه اسیدی است، نمونه به درون منبع یون از طریق یک نبولایزر متصل به پمپ پریستالتیک داده میشود.نمونه افشانده شده به درون یک پلاسمای داغ ،ایجاد شده به وسیله یک منبع جفت کننده القایی که از یک ژنراتور با فرکانس رادیویی پرتوان بهره میگیرد رانده میشود.یک روزنه کوچک از پلاسما نمونه برداری میکند و یونها از طریق یکسری مراحل پمپینگ افتراقی به درون انالایزر جرمی رانده میشوند.دستگاه نمونه برداری در فشار جو از دیدگاه مفهومی همانند دیگر منبع های یون است که در فشار جو کار میکنند با این تفاوت که این دستگاه می بایست دماهای بی اندازه بالای تولید شده توسط پلاسما را تحمل کند.
ICP-MS بطور مقایسه ای از بسیاری از تداخل ها به دور است.با این حال برخی گونه های مداخله گر می توانند بی اندازه مشکل ساز شوند.بیشتر گونه های مداخله گر یونهای پلی اتمی (polyatomic ions) هستند که از طریق واکنشهای یون –مولکول در شعله تشکیل میشوند.برای مثال ArO+ با اهن در m/z 56 تداخل میکند.یک راه حل برای این مشکل بکار بردن یک سلول واکنش است که از یک گاز با فشار متوسط تشکیل شده و پیش از m/z analyzer قرار گرفته است .یک گاز واکنشگر مانند NH3 به درون سلول واکنش روانه میشود. گاز واکنشگر با مداخله گرهای پلی اتمی واکنش میدهد و انها را پیش از روانه کردن به m/z انالایزر برداشت میکند. روش دیگر برای برداشت مداخله گرها با جرم اسمی یکسان استفاده از یک اسپکترومتر جرمی با توان جداسازی بالا است که توانایی جداسازی گونه هایی با جرم اسمی همانند را دارا است.برای مثال جرم های ArO+ و 56Fe+ به اندازه 0.022 Da با یکدیگر فرق دارند که به اسانی توسط یک اسپکترومتر جرمی با توان جداسازی بالا از هم تشخیص داده میشوند.
کندن / یونیزه کردن لیزری به کمک ماتریکس
Matrix-assisted laser desorption/ionization=MALDI))
MALDI و تکنیک های مرتبط بر پایه فرایندهای انتقال انرژی از پرتوهای لیزری پالسی به نمونه برای تولید یون ها است.در بیشتر موارد ،انالیت در یک محلول ماتریکس که یک ترکیب با وزن مولکولی کم و جذب کننده پرتو فرابنفش است،حل میشود.این محلول بر روی یک هدف گذاشته میشود تا سپس به سوی اسپکترومتر جرمی فرستاده شود.یک لیزر فرابنفش مقدارهای کمی از ماتریکس و انالیت را به یک ابری از یونها تبخیر میکند که به سمت انالیزر جرمی روانه میشود (شکل 14-6).
MALDI یکی دیگر از تکنیکهای نرم به شمار میرود.تکنیکهای مرتبط شامل MALDI در فشار جو است که در ان فرایند MALDI بجای فشار کم در فشار جو رخ میدهد ، و تکنیک surface-enhanced laser desorption ionization (SELDI) است که از سطح هدف MALDI، بهبود یافته به وسیله برخی انواع ویژگی های گیرندگی بر پایه میل ترکیبی بهره میگیرد ویژگی هایی مانند هیدروفوبی ، یونی و کروماتوگرافی میل ترکیبی برپایه فلز نامتحرک شده ((immobilized metal affinity chromatography=IMAC ، DNA ، انتی بادی و همانند اینها.
روشهای یونیزاسیون با بهره بالقوه
(ionization methods of potential interest)
Sonic spray ionization (یونیزاسیون به روش تولید افشانه به کمک صدا) یکی دیگر از روشهای یونیزاسیون است که از لیزر استفاده میکند که در اسپکترومتری جرمی بالینی کاربرد بالقوه دارد.تا کنون معلوم نیست که ایا این فناوری برتری کافی بر ESI و APCI دارد تا کاربردی گسترده تر پیدا کند یا نه ،اگر چه کاربردهایی در انالیز ترکیبهای ناپایدار در برابر گرما دارد.desorption electrospray ionization(DESI) و direct analysis in real time (DART) دو تا از روشهای نسبتا جدید هستند که تولید یون ها از سطح را در فشار جو انجام میدهند .بسیاری از کاربردهای DESI و DART تا به امروز متوجه کم کردن فرایند اماده سازی نمونه بوده است.
روشهای یونیزاسیون با پیشینه تاریخی
(ionization methods of historical interest)
نوشتارهای قدیمی شامل چندین روش یونیزاسیون یا روشهای عرضه نمونه است که اگرچه امیدبخش و یا دارای کاربرد گسترده ای در یک زمانی بوده اند اما در این زمان در شیمی بالینی علاقه کمی به انها است.این ها شامل 1) بمباران اتمی سریع (fast atom bombardment=FAB) 2) افشاندن گرمایی (thermospray=TSI) 3) عرضه مستقیم مایع (direct liquid introduction=DLI) 4) کندن پلاسمایی (plasma desorption) 5) یونیزاسیون در میدان (field ionization=FI) 6) کندن توسط میدان (field desorption= FD) 7)surface ionization mass spectrometry 8) کندن به کمک لیزر (laser desorption =LD) و دیگر موارد.منبع یون های ESI و APCI این تکنیکها را به کنار رانده است.
سیستم خلا
(vacuum system)
به غیر از برخی اسپکترومترهای جرمی به دام اندازنده یون ،جداسازی یون ها در هر انالایزر جرمی نیازمند این است که یونها با دیگر مولکولها طی برهم کنش با میدان های مغناطیسی و الکتریکی برخورد نکنند.این نیازمند استفاده از سیستم خلا از
10^-3 – 10^-9 torr بسته به نوع انالایزر جرمی است.درارای مسیر یون در انالایزر می بایست کمتر از میانگین درارای مسیر ازاد باشد مگر اینکه برخوردها نقشی در انالیز جرمی بازی کنند.fourier transform ion cyclotron resonance(FT-ICR) نیازمند کمترین فشار (10^-9 torr) است. Quadrupole ion trap (QIT) بالاترین فشار (10^-3 torr) را تحمل میکند، گستره فشاری که برخی برخوردها بین یونها و گاز پس زمینه رخ میدهد.بررسی های تضمین کیفیت معمول برای نشت خلا شامل ارزیابی هوا و اب در انالایزر جرمی می بایست انجام شود.
پمپهای موثر خلا بالا معمولا نزدیک فشار جو خوب عمل نمیکنند.بنابراین سیستم خلا باید یک پمپ خلا مکانیکی داشته باشد تا سیستم را به فشاری تخلیه کند که در ان فشار پمپ های خلا بالا موثر عمل کنند.پمپ دیفیوژن (diffusion pump) کمتر گران بوده و مطمین ترین پمپ خلا بالا به شمار میرود.پمپ های توربومولکولار (turbo-molecular pumps) و کرایوپمپ ها (cryopumps) نیز در انالایزرهای جرمی استفاده شده اند و پمپهای دیفیوژن را کنار رانده اند.یک ملاحظه کلیدی در ساخت سیستم های خلا سرعت پمپ کردن است .توانایی پمپ در برقراری خلا با برداشت گازی(یا بخار حلال) که وارد سیستم میشود سرعت جریان گاز یا مایع را که به درون اسپکترومتر جرمی وارد میشود تعیین میکند.بطور کلی توانایی بالای پمپ های خلا همراه است با حد تشخیص پایین تر چون نویز برخاسته از گاز پس زمینه کاهش پیدا میکند.
انالایزرهای جرمی ،اسپکترومترهای جرمی پیاپی و اشکارسازهای یون
(mass analyzers,tandem mass spectrometers,and ion detectors)
واژه اسپکترومتری جرمی تا اندازه ای نام نادرستی است چون اسپکترومترهای جرمی جرم مولکولی را اندازه نمیگیرند بلکه نسبت جرم به بار (mass to charge ratio) را اندازه میگیرند.این حقیقت پایه اصول عملکرد فیزیکی اسپکترومترهای جرمی است و در نتیجه همه جنبه های طراحی دستگاهی و عملکرد ان و تفسیر نتایج را تحت تاثیر میگذارد.نماد m/z برای نشان دادن نسبت جرم به بار بکار میرود و بطور قراردادی به عنوان یک کمیت بدون واحد تعریف شده است.با این حال یک نسبت بدون واحد جرم به بار با معادله های حرکت یونها در حضور میدان های الکتریکی و مغناطیسی که نیازمند واحد جرم به بار است ،سازگار نیست.دیگر اینکه مقیاس m/z گاهی در رابطه با واژه دالتون کمتر بحث شده است و دالتون واحد جرم است و نه نسبت جرم به بار.برخلاف موضوع این نامگذاری ها ،این فصل دستور قراردادی را با بحث m/z بصورت جرم و دالتون دنبال میکند.
برای کمک به پرهیز از برخی اشتباه های دربرگیرنده استفاده از m/z ،پیشنهاد شده است که باید بطور ویژه به عنوان یک کمیت دارای واحد باشد که جرم با استفاده از دالتون و بار با استفاده از بارهای عنصری بیان شود و این واحد باید به یادبود یک از پیشتازان اسپکترومتری جرمی Thomson (Th) نامیده شود.این نامگذاری گاهی در نوشتار حاضر دیده میشود اما تاکنون بطور گسترده جا نیفتاده است.
کلاسهای کلی اسپکترومترهای جرمی
(general classes of mass spectrometers)
اسپکترومترهای جرمی به دو گروه دسته بندی میشوند: beam-type instruments و trapping –type instruments .در یک دستگاه نوع beam یون ها از میان دستگاه میگذرند و سپس اشکارساز را برمی انگیزانند جایی که به شکل دگرگون شده تشخیص داده میشوند.همه فرایند از زمانی که یک یون وارد انالایزر میشود تا زمانی که شناسایی میشود ممکن است چند میکروثانیه تا چند میلی ثانیه طول بکشد.
در یک انالایزر نوع trapping در یک ناحیه محدود شده فضایی از طریق ترکیب میدان های مغناطیسی و یا الکتروستاتیکی و یا رادیو فرکانس الکتریکی نگاه داشته میشوند.میدان های به دام اندازنده به شیوه ای دستکاری میشوند که اندازه گیری m/z انجام شود.زمان های به دام اندازی (trapping) ممکن است از کسری از یک ثانیه تا چند دقیقه طول بکشد اگر چه بیشتر کاربردهای بالینی در انتهای پایین این گسترده است.شناسایی یونها در یک دستگاه نوع trapping ممکن است دگرگون کننده یا غیردگرگون کننده باشد و بستگی به نوع خاصی از اسپکترومتر جرمی دارد که استفاده میشود.در این نوشتار " دگرگون کننده " به این معنی است که یونها در فرایند شناسایی تخریب میشوند.بحثهای اضافی انالایزرهای جرمی ،اسپکترومترهای جرمی پیاپی و اشکارسازهای یون نیز در دسترس هستند و یک سند CLSI حاوی توصیه هایی در مورد سازگاری توانمندی m/z انالایزرهای مختلف برای کاربردهای مختلف است.
طراحی های نوع beam
(beam-type designs)
طرح های اصلی اسپکترومترهای جرمی نوع beam شامل 1) quadrupole 2) magnetic sector 3) time-of-flight (TOF) میباشد.اسانتر است اگر دستگاه های نوع beam را به دو دسته گسترده تر تقسیم بندی کنیم، انهایی که با اسکن کردن بازه ای از m/z در برابر پاره ای از زمان یک طیف جرمی تولید میکنند (quadrupole و magnetic sector) و انهایی که تصویرهای بی درنگ پی در پی از طیف جرمی میگیرند (TOF). برخی از دستگاه ها طوری طراحی شده اند که عملکردهای اسکن کننده یا غیر اسکن کننده دارند.با این حال این دسته بندی مفید است چون بیشتر دستگاه های موجود را پوشش میدهد و نیز دستگاه های اسکن کننده و غیراسکن کننده برای کاربردهای مفید دیگری طراحی شده اند.
Quadrupole. اسپکترومترهای جرمی کوادراپل که گاهی فیلترهای جرمی کوادراپل نیز گفته میشوند اکنون از گسترده ترین اسپکترومترهای جرمی در حال استفاده هستند و اسپکترومترهای جرمی نوع magnetic sector را به عنوان یک دستگاه استاندارد به کنار رانده است.اگر چه این دستگاه ها از نظر 1) حساسیت 2) بازه جرمی بالاتر 3) توانایی جداسازی 4) صحت جرمی پس از دستگاه های magnetic sector قرار میگیرندبا این حال این دستگاه ها برخی ویژگی های عملکردی را ارایه میدهند که دلیل محبوبیت انها است شامل 1) کاربری اسان 2) انعطاف پذیری 3) کارایی کافی برای بیشتر کاربردها 4) کم هزینه بودن نسبی 5) نیازمندی های نه چندان مهم از نظر مکان 6) سیستم های نرم افزاری بسیار پیشرفته .
یک اسپکترومتر جرمی کوادراپل از چهار میله موازی رسانای الکتریسیته تشکیل شده است که در یک ارایه مربعی شکل مرتب شده اند (شکل 14-7)
چهار میله یک کانال درازی را تشکیل میدهند که از طریق ان پرتو یون میگذرد.پرتو نزدیک به محور در یک انتهای ارایه وارد میشود و در جهتی معمولا همسو با محور عبور میکند و از انتهای دور ارایه خارج میشود.پرتو یونی که وارد ارایه کوادراپل میشود ممکن است مخلوطی از یونها با مقدارهای مختلف m/z باشد اما تنها یونهایی که یک بازه m/z بسیار باریک (معمولا Δm/z <1) دارند با موفقیت از طریق دستگاه برای رسیدن به اشکارساز میگذرند.یونهایی که از خارج از این بازه باریک هستند بطور شعاعی از مرکز طرد میشوند.بازه Δm/z نمایانگر یک باند عبوری است همانند باند عبوری یک فیلتر اینترفرانس در اپتیک و بهمین دلیل است که اسپکترومترهای جرمی کوادراپل را اغلب فیلترهای جرمی میشناسند تا اسپکترومترهای جرمی .
اسپکترومترهای جرمی کوادراپل متکی بر جایگاه ارزشمند رادیوفرکانس و جریان مستقیم ثابت یا پتانسیلهای DC بکار رفته در میله های کوادراپل است.ولتاژهای DC در یک الگوی چهار قطبی به الکترودها اعمال میشوند.برای مثال یک پتانسیل DC مثبت به الکترودهای 1 و 3 اعمال میشود همانطور که در شکل 14-8 نشان داده شده است و پتانسیل های DC منفی هم ارز به الکترود های 2 و 4 اعمال میشود.
پتانسیل های DC نسبتا کوچک هستند ،به اندازه چند ولت.بالاتر از پتانسیل های DC ،پتانسیل های RF هستند که انها هم به شکل چهار قطبی اعمال میشوند.پتانسیل های RF در بازه کیلو ولت هستند و فرکانس انها در حدود 1 MHz .فرکانس بطور طبیعی ثابت است و بسیار پایدار اگرچه عملکرد فرکانس متغیر نیز در اساس امکان پذیر است.
اصول فیزیکی زیربنایی عملکرد یک اسپکترومتر جرمی کوادراپل به وسیله معادله های دیفرانسیل پیچیده با جزییات، با نام معادله Mathieu توصیف شده است.هنگامی که یک یون در معرض یک میدان RF چهار قطبی قرار میگیرد، مسیری که میپیماید (trajectory) به صورت کیفی به عنوان ترکیبی از حرکت های سریع و اهسته چرخشی (oscillatory) توصیف میشود.برای فهم بهتر،از جز سریع در این جا صرف نظر میشود.جز اهسته حول محور چهار قطبی میچرخد،این به مانند حرکت یک ذره در یک شبه پتانسیل هماهنگ ساختگی است.فرکانس این چرخش گاهی فرکانس سکولار نامیده میشود.
نیروی موثر همراه با این شبه پتانسیل به سمت درون و به سمت محور چهار قطبی است و متناسب با میزان فاصله از محور است.بنابراین ان به عنوان یک نیروی محدود کننده عمل میکند که از طرد شدن یون ها به طور شعاعی از این ساختار چهارقطبی پیش گیری میکند.شکل 14-9,A یک نمون از یک یون را نشان میدهد که به وسیله چهار قطبی RF تنها (RF-only quadrupole) محدود شده است.
پایین تر از یک فرکانس کات اف (cutoff) معین m/z (که بستگی به فرکانس و بزرگی میدان RF دارد)، یون ها بیشتر طرد میشود تا اینکه محدود شوند. شکل 14-9,B یک نمونه از یک یون را نشان میدهد که به وسیله یک میدان چهار قطبی RF تنها ، طرد شده است.این کات اف جرمی پایین را برای باند عبوری m/z برقرار میکند.نیروی محدود کننده موثر، درست بالای این کات اف جرمی پایین ، قویترین است و سپس در m/z های بالا بدون هیچ علامتی به سمت صفر کاهش می یابد.
بخش DC پتانسیل چهار قطبی مستقل از m/z است.یونهای مثبت به سمت قطبهای منفی جذب میشوند.یونهای منفی به سمت قطب های مثبت جذب میشوند.همانطور که فاصله از محور چهارقطبی افزایش پیدا میکند جذب نیز افزایش می یابد.از انجایی که پتانسیل DC چهار قطبی همیشه قطبهای مثبت و منفی را دارد ،پتانسیل DC چهار قطبی همیشه دست کم در یک جهت در طرد یونها همکاری دارد.اینکه طرد یک یون با یک m/z ویژه بطور واقعی رخ بدهد بستگی به این دارد که ایا نیروی طرد کننده ایجاد شده به وسیله پتانسیل DC چهار قطبی بر نیروی محدود کننده موثر ایجاد شده به وسیله شبه پتانسیل میدان RF برتری می یابد یا نه .بالاتر از یک مقدار m/z معین ،بخش DC برتری می یابد و یون ها بطور شعاعی از دستگاه طرد میشوند.این یک حد بالای m/z را برای گذر یونها برقرار میکند.شکل های 14-9,C,D مثالهایی از خط سیر یونها را تحت تاثیر میدان های RF-DC ترکیب شده نشان میدهد که یکی دارد میحدود میشود و دیگری دارد طرد میشود.خط سیرها در شکل 14-9 با استفاده از یک نرم افزار کامپیوتری براورد شده اند.
توصیف دقیقی از کات اف جرمی پایین و بالا (low – and high-mass cutoff) در نموداری به نام نمودار پایداری (stability diagram) قابل فهم است که به طور نموداری کات اف های پایین و بالای یک اسپکترومتر جرمی کوادراپل را به صورت پارامترهایی مرتبط با ولتاژ ،فرکانس و m/z بیان میکند. ویرایش سوم این کتاب یک مثال از نمودار پایداری را ارایه میدهد.با این حال برای درک کامل معنای نمودار پایداری باید به توصیف های ریاضی پرداخت تا انچه که در این جا گفته میشود.
ترکیب حد پایین و بالای m/z یک باند عبوری را برقرار میکند (Δm/z) ، در نهایت یک توانایی جداسازی (=resolution) ((m/z) / Δm/z) معین میشود.با استثناهای نسبتا کم،دستگاه های کوادراپل محدود به یک توانایی جداسازی چند هزاری هستند که برای رسیدن به توانایی حداسازی ایزوتوپی در مورد یونهای تک بار با m/z به بزرگی چندین هزار کافی است.
یک اسپکترومتر جرمی کوادراپل ممکن است در حالت SIM یا در حالت scanning کار کند.در حالت SIM هر دو ولتاژهای DC و RF ثابت هستند.در نتیجه هم مرکز باند عبوری و هم پهنای باند عبوری ثابت هستند.برای مثال یک اسپکترومتر ممکن است اینگونه تنظیم شود که یونهای با m/z 363±0.5 را عبور دهد.هر دو پارامتر مرکز m/z و هم Δm/z با گزینش مناسب Dc و RF تنظیم میشوند.
در حالت scanning ،ولتاژهای RF و یا DC بطور پیوسته تغییر میکنند تا یک بازه ای از مقدارهای m/z را اسکن کند.همانند حالت SIM ،Δm/z به وسیله ولتاژهای RF و DC تعیین میشود.معمولا عملکرد اسکن طوری طراحی میشود که یک Δm/z ثابت را در سراسر گستره m/z برقرار کند.بنابراین توانایی جداسازی با افزایش m/z ، افزایش می یابد.مقدار Δm/z بیشتر در بازه 0.5 – 0.7 انتخاب میشود تا پیک های ایزوتوپی را در سرتاسر گستره m/z تفکیک کند.
Magnetic sectors . از انجایی که اسپکترومتری جرمی برش مغناطیسی (magnetic sector mass spectrometry) بسیار کم در ازمایشگاه بالینی استفاده میشود بنابراین در اینجا به طور جزیی به ان پرداخته نمیشود. به عنوان اشنایی با فناوری برش مغناطیسی به ویرایش سوم این کتاب مراجعه کنید.باید یاداوری کرد که با این حال این اسپکترومترهای جرمی کلاسیک را به اسانی میتوان فهمید (با فرض اینکه فهم پایه ای از فیزیک باشد)، بسیار کاربردی ، قابل اعتماد و بسیار حساس بوده و از نظر تغییرات تمرکز دوباره (double focusing variation) دارای توانایی جداسازی m/z و صحت جرمی بسیار بالا هستند.با این حال انها کار با انها سخت است.در نتیجه دیگر دستگاه ها اسپکترومترهای جرمی برش مغناطیسی را به میزان زیادی به کنار رانده اند.
Time-of-flight (TOF). اسپکترومترهای جرمی TOF یک تکنیک بدون اسکن است که به وسیله ان یک طیف جرمی کامل به عنوان یک عکس گرفته میشود بجای اینکه یکسری مقدارهای پشت سرهم از m/z با نمونه برداریهای پیاپی از نمونه ،گرفته شود.اسپکترومترهای جرمی TOF چندین برتری دارند شامل 1) یک گستره m/z تقریبا نامحدود 2) سرعت بسیار بالا 3) صحت جرمی بیسیار بالا 4) توانایی جداسازی نسبتا بالا 5) جساسیت بالا 6) هزینه منطقی .همچنین انها با منبع های یونی پالسی بسیار سازگار هستند که یک برتری در برخی کاربردها به ویژه با MALDI و تکنیکهای مرتبط به شمار میاید.
یک برتری اصلی اسپکترومترهای جرمی TOF مدرن ان است که برخی از انها اندازه گیری های جرمی چنان صحیحی انجام میدهند که به راحتی میتوان گفت جرم دقیق است که بطور معمول به اندازه یک بخش در یک میلیون (parts per million=ppm) صحیح اندازه میگیرد.این توانایی به اندازه گیرهای TOF این امکان را میدهد که فرمول مولکولی یک ترکیب را تایید کند.برخلاف اسپکترومترهای جرمی برش مغناطیسی که انها هم توانایی اندازه گیری های جرمی صحیح را دارند ،اسپکترومترهای جرمی TOF از دیدگاه مفهوم ساده هستند چون بر پایه این حقیقت استوار هستند که یون سبک تر سریع تر از یون سنگین تر حرکت میکند به شرطی که هر دو انرژی کینتک یکسانی داشته باشند.شکل 14-10 یک نمودار مفهومی ساده شده از یک اسپکترومتر جرمی TOF را نشان میدهد. ان نمایانگر یک لوله دراز است. یون ها در پایانه منبع دستگاه ایجاد و یا تزریق شده و سپس به وسیله یک پتانسیل چند کیلو ولتی شتاب داده میشوند.انها به سمت پایین لوله پرواز (flight tube) حرکت میکنند و در انتهای دور لوله پرواز (flight tube) اشکارساز را بر می انگیزانند.
زمانی که طول میکشد تا یون لوله را بپیماید،زمان پرواز (flight time) نامیده میشود، این زمان با نسبت جرم به بار یون در ارتباط است.
زمان پرواز برای یک یون با جرم m و انرژی کینتیک E برای پیمودن فاصله L در یک ناحیه بدون میدان الکتریکی از فرمول زیر بدست میاید .
یک براورد نمونه برای یک یون با وزن مولکولی 200 Da (3.32*10^-25 kg) با یک انرژی کینتیک 10 keV (1.60*10^-15J) که فاصله ای به طول 1 m را می پیماید زمان پرواز ان 10.18 ms میشود و یک یون با وزن مولکولی 201 درست 25 ns بیشتر زمان میبرد.برای گرفتن درست چنین سیگنالهای بسیار گذرا ، سیستم های ثبت داده باید به اندازه یک نانوثانیه یا کمتر به درستی عمل کنند.پیشرفت ها در الکترونیک پردازش سیگنال ها این کار را با یک هزینه ای نسبتا میانه عملی کرده است و همین باعث افزایش در محبوبیت TOF-MS شده است.
TOF در اصل یک تکنیک پالسی است،به اسانی با روشهای یونیزاسیون پالسی جفت میشود،با MALDI به عنوان معمول ترین نمونه به شمار میرود اگر چه این امکان هم وجود دارد که TOF را با منبع های یون پیوسته مانند یونیزاسیون الکترونی(EI) ، یونیزاسیون الکترواسپری(ESI) و یونیزاسیون شیمیایی در فشار جو (APCI)هم جفت کرد.با این حال ماهیت پیوسته این منبع ها باعث یک ناسازگاری طبیعی بین منبع های یون پیوسته و TOF-MS میشود که یک تکنیک پیوسته به شمار میرود. بر این ناسازگاری با استفاده از یک تکنیکی به نام orthogonal acceleration TOF-MS (OA-TOF-MS) که در ان پرتو یونی به صورت اورتوگونال (orthogonal) (راست گوشه ای ) به محور TOF-MS تزریق میشود غلبه شده است ..طی دوره تزریق ولتاژ شتاب خاموش میشود.هنگامی که ناحیه تزریق با پرتو پیماینده پر شد،ولتاژ شتاب به سرعت روشن میشود و چرخه زمانی TOF اغاز به کار میکند.این فرایند به طور دوره ای تکرار میشود.کارایی کلی چرخه برای این روش میتواند بیش از 10% باشد،این نمایانگر یک بهبود بزرگ نسبت به روشهای سنتی مسیرگذاری برای پرتو یون میباشد.در مورد توانایی طیف سنجی کامل با منبع های یون پیوسته ،اسپکترومترهای جرمی TOF با تزریق اورتوگونال بطور کلی پایین ترین حد تشخیص را در بین همه اسپکترومترهای جرمی دارند.با این حال در مورد پایش یک m/z تک نسبت به یک طیف جرمی کامل ،استفاده از حالت SIM با یک اسپکترومتر جرمی کوادراپل بالاترین حد تشخیص را فراهم میکند.
توانایی جداسازی بهبود یافته یک برتری دیگری است که به وسیله شتاب اورتوگونال انطور که در اسپکترومتری TOF بکار رفته ، بدست امده است.اگر چه توضیح کامل ان خارج از هدف این کتاب است اما بطور مختصر شتاب اورتوگونال اثرات مخرب بر توانایی جداسازی را که در حالت طبیعی همراه با تغییرات انرژی کینتیک یونهای تک در یک پرتو یونی است را کاهش میدهد.استفاده از یک اینه یونی (ion mirror) یک تکنیک دومی است که بیشتر با طراحی های اسپکترومتری جرمی TOF برای بهبود توانایی جداسازی به وسیله جبران در تغییرات انرژی کینتیک بکار میرود.چنین دستگاه هایی را بنام رفلکترون (reflectrone) میشناسند.تا به امروز اسپکترومتری جرمی TOF تاثیر کمتری بر شیمی بالینی داشته است اما به نظر میرسد که در اینده نقش بزرگتری را بر عهده بگیرد.برای مثال توانایی گرفتن طیف کامل ،توانایی جداسازی بالا (تا 40000 در برخی دستگاه های کنونی ) ،سرعت بالا (10 تا 100 طیف ذخیره شده در ثانیه ) ، و صحت جرمی بالای اسپکترومتری جرمی TOF به نظر میرسد که در کاربردهایی مانند غربالگری داروها با سرعت بالا در سم شناسی بسیار مناسب باشد به ویژه هنگامی که با نمونه گذاری به روش کروماتوگرافی سریع ترکیبی شود.
حیطه دیگری از اسپکترومتری جرمی TOF که یک برتری دیگر را فراهم میکند انالیز جرم بالا (high-mass analysis) است که بازه جرمی ان تقرییبا نامحدود است.برای مثال در MALDI-TOF غیر معمول نیست که پروتیین هایی با وزن مولکولی بالاتر از 100000 را شناسایی کرد.توانایی در انالیز جرم بالا انتظار میرود که بر اهمیت ان در جفت کردن ازمایشگاه بالینی با روش های تشخیصی بر پایه پروتئومیک بیفزاید.
اسپکترومترهای جرمی به دام اندازنده
(Trapping mass spectrometers)
برخلاف طراحی های نوع پرتویی (beam-type design) این اسپکترومترهای جرمی بر پایه به دام انداختن یونها هستند تا یون ها را گرفته و برای یک مدتی از زمان در یک ناحیه کوچکی از فضا انها را نگه دارند.زمان های به دام اندازی از کسری از یک ثانیه تا چند دقیقه متغیر است.در مقایسه با دستگاه های نوع پرتویی ،تقسیم بندی میان دستگاه های اسکن کننده و غیر اسکن کننده درباره دستگاه های به دام اندازنده یون معنای کمتری دارد.تفاوت عملی عمده میان دستگاه های اسکن کننده و غیر اسکن کننده مربوط به انحراف در داده های طیف جرمی کروماتوگرافی میشود که از زمان اسکن محدود در اسپکترومتر جرمی و در ارتباط با پهنای پیک کروماتوگرافی در نمودار عرضه نمونه کروماتوگرافی ریشه میگیرد (کشیدگی پیک =peak skew) .در رابطه با تولید طیف های دنباله دار (skewed spectra)، دستگاه های به دام اندازنده بیشتر شبیه به دستگاه های غیر اسکن کننده مانند TOF (بدون دنباله ) هستند تا اینکه شبیه به دستگاه های اسکن کننده باشند.این به این خاطر است که نمونه در یک ان گرفته میشود و سپس با اسودگی انالیز میشود.از انجایی که نمونه در یک ان گرفته میشود، هیچ دنباله ای در طیف رخ نمیدهد جدا از اینکه انالیز m/z به روش اسکن یا روش غیر اسکن انجام شود.
بطور سنتی به دام اندازی یون بدین گونه تقسیم بندی میشود 1) quadrupole ion trap (QIT) که بر پایه میدان های RF برای به دام اندازی یون ها است 2) linear ikon trap که بسیار نزدیک به QIT در اصول عملکردی است و 3) ion cyclotron resonance (ICR) که بر پایه ترکیبی از میدان های مغناطیسی و میدان های الکتروستاتیک برای به دام اندای یون ها است. یک روش چهارم که orbitrap نامیده میشود تازه ترین روش در زمینه به اسپکترومتری جرمی به دام اندازنده یون است.
Quadrupole ion trap. دستگاه های به دام اندازی یون به این روش نسبتا فشرده ،ارزان و کابرد گسترده دارند که برای 1) مطالعه های کاوشگرانه 2) تعیین ساختار 3) و شناسایی نمونه بکار گرفته میشوند.از این دستگاه ها همچنین برای انالیز کمی استفاده میشود اگر چه انالیز کمی برای این دستگاه ها در مقایسه با دستگاه های بر پایه کوادراپل یک کاربرد عالی ه شمار نمی اید.
عملکرد quadrupole ion trap بر پایه همان اصول فیزیکی است که پیشتر برای اسپکترومترهای جرمی کوادراپل توصیف شد.هر دو نوع دستگاه از توانایی میدان های RF برای محدود کردن یون ها استفاده میکنند.با این حال میدان RF در یک به دام اندازنده یون طوری طراحی شده که یون ها در سه بعد به دام بیافتند تا اینکه مانند QMF یون ها از ان بگذرند و در دو بعد محدود شوند.این تفاوت اثر بزرگی بر عملکرد و محدودیت های quadrupole ion trap دارد.
چینش فیزیکی quadrupole ion trap متفاوت از چینش QMF است.اگر یک محور فرضی از طرییق محور y میله های کوادراپل کشیده شود و میله ها دور محور بچرخد یک حلقه جامد با یک سطحی داخلی هایپربولیک از جفت میله های محور x بدست میاید.جفت میله های محور y دو درپوش انتهایی جامد را تشکیل میدهند. نمایی از یک به دام اندازنده یون در شکل 14-11 نشان داده شده است.
توصیف میدان ها درون الکترود ها اکنون باید شامل یک جز شعاعی و یک جز محوری (بین درپوش های انتهایی) باشد.این طراحی وضعیت دقیق مورد نیاز برای محدود کردن یون را در مقایسه با QMF به طور جزیی تغییر میدهد اگر چه توصیف های کیفی محدود کردن یون که پیشتر بحث شد هنوز در اینجا هم درست است.
Quadrupole ion trap از دیدگاه بحث در باره روشهای اسکن کردن فراتر از هدف این کتاب است بجز اینکه باید یاداوری کرد که یونها با یک الگوی وابسته به m/z برای شناسایی با استفاده از یک الکترون مالتی پلایر بیرونی ، پس از به دام افتادن طرد میشوند.
Quadrupole ion trap ها در بین اسپکترومترهای جرمی پر کاربرد تنها در این زمینه به وسیله اسپکترومتری جرمی ICR مورد رقابت قرار گرفته است.یاداوری ان بجاست که quadrupole ion trap ها به ویژه برای انجام مراحل زیاد اسپکترومتری جرمی پی درپی (MS^n) بسیار سازگار هستند.quadrupole ion trap همچنین در برخی برتری ها با TOF-MS شریک است.اسپکترومتری جرمی به دام اندازنده یون به ویژه بخاطر حساسیت بالای خود شناخته شده است.دیگر اینکه نمونه برداری از فرایند اسکن کردن جدا شده است و بنابراین هیچ کشیدگی پیک طیفی در GC-MS و HPLC-MS دیده نمیشود.با این حال بخاطر اثر دفع کنندگی یون – یون که میتواند بازه دینامیکی را کاهش دهد و در سیگنال های بالا سبب نسبت دهی نادرست جرمی شود quadrupole ion trap ها به نظر نمی رسد که برای کاربردهای انالیز کمی که در شیمی بالینی دز زمان کنونی بسیار امری غالب است ، عالی باشند.
Linear ion trap. این یک به دام اندازی یون به وسیله RF است که بر پایه QMF خطی اصلاح شده استوار است. بجای اینکه یک دستگاه عبوری باشد همانجور که در یک QMF خطی نرمال است ، میدان های الکتروستاتیک در پایانه ها بکار میروند تا از خروج یون ها از پایانه ها جلوگیری کنند.هنگامی که به این شیوه یون ها به دام بیفتند ،یون ها را میتوان به شیوه های بسیاری انطور که در QIT استفاده میشود ،انها را دستکاری کرد.یک برتری linear quadrupole trap ان است که میدان به دام اندازنده را میتوان هر ان خاموش کرد و دستگاه به صورت یک QMF نرمال کار کند.بنابراین یک چنین دستگاه به تنهایی بیشتر ویژگی های یک QIT و QMF را ترکیب میکند و بی اندازه کارایی دارد.اسپکترومتری جرمی کوادراپل سه تایی (triple quadrupole mass spectrometry) تجاری شده عرضه شده که در ان کوادراپل سوم یه عنوان یک linear trap عمل میکند.کاوش در توانایی های linear ion trap یک زمینه بسیار فعال در تحقیقات است و توانایی های بسیار جدید دیگری را در چند سال اینده میتوان از ان امید داشت .
Ion cyclotron resonance (ICR) . اسپکترومتری ICR از دیدگاه توانایی جداسازی بالا و صحت جرم بالا (high-mass accuracy) عالی عمل میکند.اندازه گیری هایی با توان تفکیک بیش از 1 میلیون با این روش غیر معمول نیست.ion cyclotron resonance یک تکنیک به دام اندازنده به شمار میرود که بسیاری از برتری های RF ion trap ها را سهیم است.با این حال حتی راه های بسیاری برای دستکاری یون ها در اسپکترومتری جرمی ICR نسبت به QIT و اسپکترومتری جرمی پی در پی (بسیاری از مراحل MS/MS ) وجود دارد که به اسانی انجام میشود.حساسیت یک اسپکترومتری جرمی ICR بطور کلی بالا است.دیگر اینکه نمونه برداری از گرفتن طیف جدا شده است و بنابراین هیچ کشیدگی پیک در ازمایش های کروماتوگرافی دیده نمیشود ، ویژگی که که ICR با TOF و QIT در ان شریک است.
یک اسپکترومتری جرمی ICR بر پایه این اصل استوار است که یون های غوطه ور شده در یک میدان مغناطیسی متحمل حرکت چرخشی (circular) (= cyclotron motion) میشوند.یک اسپکترومتری جرمی ICR از یک مغناطیس بسیار هادی با میدان بسیار قوی ( 3 تا 12 تسلا ) بهره میگیرد.درون این میدان و درون یک خلا ،یک سلول کارگذاشته شده است که از شش الکترود فلزی تشکیل شده و بصورت وجه های یک مکعب جای گرفته اند.یون ها درون سلول معلق میشوند و یک حرکت چرخشی را متحمل میشوند که مانع از دست رفتن انها در جهت شعاعی ( جهت شعاعی جهت قایم به خطهای میدان مغناطیسی تعریف میشود) میشود. یک پتانسیل کم (-1V) به درپوشهای انتهایی اعمال میشود تا مانع ترک یونها از دام بصورت محوری شود.بنابراین ترکیب میدان های الکتریکی و مغناطیسی یون ها را درون سلول محدود نگه میدارد.
هر m/z همراه با یک فرکانس سیکلوترون (cyclotron frequency) خاص است.یون هایی که درون سلول ICR در حال چرخشند یک جریان الکتریکی در الکترودهای تشخیصی القا میکنند و پس از عملیات های ریاضی خاص بر روی سیگنال (fourier transform=FT)،یک طیف جرمی بازسازی میشود.هر مقدار m/z که در نمونه است یک پیک در سیگنال تبدیل شده تولید میکند.بخاطر استفاده زیاد از FT در ICR ،این تکنیک اغلب به نام FT-ICR یا FTMS شناخته میشود.
اگرچه این تکنیک برتری های زیادی دارد شامل 1) صحت جرمی بالا 2) توانایی جداسازی بسیار بالا 3) توانایی انجام اسپکترومتری پی در پی ، با این حال چندین ویژگی نامطلوب دارد شامل 1) هزینه دستگاه بالا است 2) نیازمندی های مکانی دستگاه از نظر فضا و از نظر محدودیتهای دسترسی بسیار است 3) این تکنیک از یک مغناطیس بسیار هادی با میدان بالا استفاده میکند 4) میدان مغناطیس بسیار بالای ان نگران های ایمنی را ایجاد میکند مانند پرواز اجسام اهنی . مشکل های عملی در کار با این دستگاه شامل 1) پاک شدن کارتهای اعتباری و دیگر نوارهای کد گذاری شده به روش مغناطیسی 2) هزینه عملیات ،مراقبت و نگه داری بسیار بالا است چون این دستگاه ها هلیوم مایع استفاده میکنند و انها هرگز نباید خشک شوند 3) یک فرد بسیار با تجربه باید با ان کار کند.
Orbitrap . مناسب بودن نوع جدیدی از انالیزر جرمی یعنی orbitrap برای انالیزهای بالینی باید مورد ارزیابی قرار گیرد.با این حال توانایی جداسازی بالا و صحت جرمی بالای orbitrap نیاز به توانمندی انرا در انالیز بالینی در اینده مورد توجه قرار میدهد.انالایزر جرمی orbitrap توانایی جرمی و صحت جرمی همانند با ICR را دارد اما به میدان مغناطیسی نیاز ندارد.این نو اوری بسیاری از نامطلوبهای ICR را که پیشتر فهرست شده بودند کاهش میدهد اگرچه هزینه ان هنوز بالا است. دستگاه های تجاری شده با این روش میتوانند به اسانی به توانایی جداسازی تا 100000 و صحت جرمی زیر 100 ppm دست یابند و نیز دارای یک گستره اندازه گیری چهار برابری بوده و نمونه برداری ان از بخش طیف سنجی ان همانند ICR جدا شده است.
یک اسپکترومتر جرمی نوع orbitrap بر پایه به دام اندازی درون میدان های الکتروستاتیک بنا شده است.دستگاه واقعی یک الکترود مرکزی میله مانند است که به وسیله الکترود بیرونی استوانه مانند در برگرفته شده است.هنگامی که یون ها بطور عمود بر الکترود مرکزی عرضه میشوند و یک پتانسیل شعاعی بین الکترود ها بکار میرود ،یون ها بطور مارپیج دور الکترود مرکزی حرکت میکنند و بطور موثری در جهت شعاعی به دام می افتند. به دام افتادن در جهت محوری یک نتیجه غیر مستقیم از شکل الکترود ها به همراه پتانسیل ها بکار رفته در الکترود ها است.بنابراین به دام افتادن یون ها شامل هم حرکت اربیتالی دور الکترود مرکزی و هم شامل چرخش محوری است.
Tietz textbook of clinical chemistry and molecular diagnostics (fifth edition)
