الکتروفورز (electrophoresis) - بخش اول

 

الکتروفورز(electrophoresis)

 

مفهوم های پایه ای و تعریف ها

الکتروفورز واژه ای است که به مهاجرت مواد حل شونده یا ذرات باردار با هر اندازه ، در یک محیط مایع و در اثر یک میدان الکتریکی گفته میشود.

زون الکتروفورز (zone electrophoresis) ، به مهاجرت مولکولها و پروتیین های باردار گفته میشود که در آن هر ناحیه پروتیین بطور کامل از ناحیه کناری یه وسیله یک ناحیه خالی از پروتیین جدا شده است و معمولا در یک محیط پایه پر روزنه انجام میشود. ناحیه های پروتیین ها با رنگ آمیزی با یک رنگ ویژه پروتیین انجام میشود و یک الکتروفروگرام (electropherogram) بدست میآید که سپس اسکن شده و به وسیله دانسیتومتر (densitometer) اندازه پروتیین هر ناحیه مشخص میشود.محیط پایه را نیز پس از خشک کردن میتوان به عنوان یک مستند برای همیشه نگه داشت.این نوع الکتروفورز پرکاربردترین تکنیک در شیمی بالینی برای جداسازی پروتیین ها در سرم ، ادرار ، مایع مغزی نخاعی ، دیگر مایع های فیزیولوژیک ، اریتروسیتها و بافتها و اسیدهای نوکلئیک در سلولهای بافتهای مختلف میباشد.

اگر چه جداسازی الکتروفورزی ماکرومولکولهای مرتبط به هم از نظر بیولوژیکی،در ژل ها ( یا کاغذها ) به عنوان ماشین کار معمول پژوهش های نوین زیست پزشکی بوده است، نوآوری به نام کاپیلاری الکتروفورز (capillary electrophoresis) جداسازی ها را بسیار دگرگون کرده است. علاقه زیاد به جداسازی به روش کاپیلاری الکتروفورز با قطرهای درونی 20 تا 75 میکرومتر بخاطر توانایی بی مانند، جداسازی سریع و توانایی در آنالیز نمونه های بسیار کم این روش الکتروفورزی میباشد.با این حال اهمیت واقعی کاپیلاری الکتروفورز در جداسازی ، در بکاربردن اصول این شیوه جداسازی به شمار زیادی از آنالیت ها مانند پپتیدها ، مولکولهای کوچک دارو مانند و حتی یونها علاوه بر پروتیین ها و اسیدهای نوکلئیک میباشد.

 

تئوری الکتروفورز (theory of electrophoresis)

بسته به باری که مواد حل شونده دارای بار حمل میکنند یا به سوی کاتد (الکترود منفی ) یا به سوی آند (الکترود مثبت ) در یک سیستم الکتروفورز حرکت میکنند.برای نمونه یونهای مثبت ( cations) به سوی کاتد و یونهای منفی (anions) به سوی آند حرکت میکنند. یک امفولیت (ampholyte) ( = مولکولی که هم دارای بار مثبت و هم دارای بار منفی است و پیشتر به آن زوویتریون گفته میشد) در یک محلولی که نسبت به نقطه ایزوالکتریک( نقطه ایزوالکتریک ، pH ای است که در آن بار خالصی وجود نداشته و مولکول در میدان الکتریکی حرکتی نخواهد کرد)  آن (pI) اسیدی تر است دارای بار مثبت میشود و به سوی کاتد حرکت میکند.و در یک محلولی که نسبت به نقطه ایزوالکتریک آن قلیایی تر است ، امفولیت دارای بار منفی میشود و به سوی آند حرکت میکند. از آنجایی که پروتیین ها دارای گروه های یونیزه شونده امینو و کربوکسیل زیادی هستند و از آنجایی که باز ها در اسید های نوکلئیک نیز دارای بار مثبت و منفی هستند ، هر دوی آنها در محلول مانند یک امفولیت کار میکنند.

میزان حرکت یونها در یک میدان الکتریکی بستگی به عامل هایی دارد که در جعبه 12-1 فهرست شده است.

معادله ای که نیروی رانش در یک چنین سیستمی را بیان میکند در زیر ارایه شده است .

که در آن

F= نیرویی که بر یک یون وارد میشود

X= قدرت جریان میدان (V/cm) ( افت ولتاژ به ازای یکای طول محیط الکتروفورز)

Q= بار خالص روی یون

EMF= نیروی الکتریکی حرکت دهنده ( ولتاژ بکار رفته )

d= طول محیط الکتروفورزی (cm)

شتاب پایدار حرکت یونها با نیروی مقاومت کننده که از ویژگی های محلول به شمار میرود روبرو میشود.این نیرو با قانون Stokes بیان میشود.

که در آن

F’ = نیروی مقاومت کننده

𝞹= 3.1416

r= شعاع یونی ماده حل شونده

ŋ = ویسکوزیتی (چسبندگی ) محلول بافر که حرکت یونها در آن رخ میدهد.

V= میزان حرکت ماده حل شونده = سرعت ، طول (l) طی شده به ازای واحد زمان (cm/s).

 

F’ با شتاب به وجود آمده به وسیله F مقابله میکند، اگر هیچ نیروی مخالفی نبود و برایند دو نیرو یک سرعت ثابت بود. بنابراین هنگامی که

آنگاه

                                                                  

یا

که در آن v/X  میزان حرکت (cm/s) است به ازای واحد قدرت میدان (E/cm) ، و به عنوان حرکت الکتروفورتیک (electrophoretic mobility) خوانده میشود. حرکت الکتروفورتیک را با µ نمایش میدهند و یکای آن cm^2 / (V) (s)  است.

حرکت الکتروفورتیک با میزان بار خالص رابطه مستقیم و با اندازه مولکول و ویسکوزیتی محیط الکتروفورز رابطه عکس دارد. در عمل از رابطه µ = m^2 / (V) (s) برای براورد حرکت الکتروفورتیک بکار گرفته میشود.برای نمونه اگر البومین به اندازه 3 cm (l) روی یک اگاروز ژل 10 سانتی متری (d) حرکت کند و این حرکت 75 دقیقه (75 * 60 s) در یک ولتاژ 250 v رخ داده باشد آنگاه

از آنجایی که یکای موبیلیتی(mobility)  به اندازه 10^-5 cm2 / (v)(s) تعریف میشود در نتیجه 2.7 واحد موبیلیتی خواهد بود. موبیلیتی ممکن است مثبت یا منفی باشد بسته به اینکه پروتیین همسو یا ناهمسو با جهت میدان الکتروفورتیک ( جهت میدان از سمت آند به سوی کاتد تعریف میشود) حرکت کند.در نمونه ای که هم اکنون بیان شد الکتروفورز در

pH  8.6  انجام شد که پروتیین ها در آن دارای بار منفی هستند بنابراین حرکت از کاتد به سوی آند رخ داده است و موبیلیتی        -2.7  واحد موبیلیتی خواهد بود.

علاوه بر عامل هایی که در جعبه 12-1 فهرست شده اند ، دیگر عامل ها که بر الکتروفورتیک موبیلیتی اثر میگذارندشامل الکترواندوسموز (endosmosis) و جریان فتیله ای (wick flow) است. الکترواندوسموز با ایجاد حرکت ناخواسته آب در محیط پایه بر موبیلیتی اثر میگذارد.یک محیط پایه الکتروفورتیک مانند یک ژل هنگامی که در تماس با آب قرار میگیرد یونهای هیدروکسیل به به خود جذب کرده و بار منفی به خود میگیرد. این یونها در سطح ثابت شده و بی حرکت هستند. یونهای مثبت محلول گرد بارهای منفی جمع میشوند و تشکیل ابری از یونهای بیشتر مثبت را میدهندشمار یونهای منفی در محلول با افزایش فاصله از جایگاه بارهای منفی افزایش یافته تا جایی که یونهای مثبت و منفی در یک غلظت برابر وجود خواهند داشت(شکل 12-1(.

 

هنگامی که جریان در چنین سیستمی بکار برده میشود، بارهای چسبیده به محیط نامتحرک ثابت باقی میمانند اما ابر یونهای موجود در محلول به سوی الکترود دارای قطب مخالف حرکت میکنند.از آنجایی که یونها در محلول بسیار هیدراته (آب پوشیده = آب پوش) هستند ، حرکت یونها سبب حرکت حلال نیز میشود.حرکت حلال و مواد حل شده در آن نسبت به محیط پایه بی حرکت اندوسموز (endosmosis) خوانده میشود و سبب حرکت ترجیحی آب به یک سو میشود.ماکرومولکولهای درون محلول که در سویی مخالف با این جریان حرکت میکنند ممکن است بی حرکت مانده و یا حتی به سوی قطب مخالف به عقب کشیده شوند در صورتی که به طور کافی باردار نشده باشند.در محیط هایی که اندوسموز قوی است مانند سلولوز استات و اگاروز ژل ناخالص ، گاما – گلوبولین ها از نقطه بکار گیری به عقب کشیده میشوند.از آنجایی که سطح درونی یک کاپیلاری شیشه ای دارای بیشمار چنین گروه هایی است اندوسموز بسیار قوی بوده و در  واقع اول نیروی رانش در مهاجرت یونها در سیستم کاپیلاری الکتروفورز میباشد. در عمل اندوسموز در کاپیلاری الکتروفورز دستکاری میشود تا بزرگی اثر اندوسموزی بهتر شود.در محیط های الکتروفورزی که بارهای سطحی در کمترین مقدار هستند ( ژل نشاسته ، اگاروز ژل خالص یا ژل پلی اکریل امید) اندوسموز نیز در کمترین مقدار خود است.

جریان فتیله ای (wick flow) از حرکت بافر به درون محیط پایه به وجود می اید. در طی الکتروفورز گرما ایجاد میشود ، بخاطر گذر جریان الکتریکی از یک محیط دارای مقاومت تبخیر حلال از محیط الکتروفورزی صورت میگیرد.این اثر خشک کنندگی سبب کشیده شدن بافر به درون محیط پایه میگردد و اگر این میزان قابل توجه باشد جریان بافر بر حرکت پروتیین ها اثر گذاشته و بر موبیلیتی براورد شده نیز اثر میگذارد.

 

الکتروفورز معمولی (conventional electrophoresis)

در این بخش 1) دستگاهی کردن  2) روشهای عمومی الکتروفورز  3) نظرداشت های عملی و فنی  4) و انواع الکتروفورزهای معمولی بحث خواهند شد.

 

دستگاهی کردن (instrumentation)

اگرچه سیستم های الکتروفورزی نوین به طور قابل توجهی در شکل و میزان خودکار بودن فرق میکنند ، با این حال بخشهای اصلی در همه این سیستم ها یکسان است.( شکل 12-2( شامل دو مخزن (1) دارای بافر بکار رفته طی فرایند است و وسیله ای برای گذر جریان الکتریکی از منبع تغذیه به وسیله الکترودهایی از جنس پلاتینوم یا کربن (2) که با بافر در تماس هستند و یک محیط پایه (support medium) (3) که جداسازی در آن رخ میدهد و نیز دو مخزن را به هم وصل میکند.در شماری از سیستم ها فتیله ها (wicks) بکار رفته که محیط پایه را به محلول بافر و یا بطور مستقیم به الکترودها وصل میکند.

همه سیستم بسته بندی میشود (5) تا تبخیر کمتر رخ داده و سیستم و کاربر دستگاه هر دو محافظت شوند.

 

منبع تغذیه (power supplies)

منبع تغذیه سبب حرکت گونه های یونی در محیط پایه میشود و میتوان با آن جریان الکتریکی یا ولتاژ را کنترل کرد. سیستم های کاپیلاری از منبع های تغذیه ای بهره میگیرند که توانایی تولید ولتاژهایی در گستره کیلو ولت را دارند

جریانی که از یک محیط دارای مقاومت میگذرد ، گرما تولید میکند.

که در آن

E= نیروی حرکت دهنده الکتریکی با یکای ولت (V)

I= جریان با یکای امپر (A)

T= زمان با یکای ثانیه (s)

این گرما به درون محیط رها میشود و پریشانی گرمایی همه یونهای حل شده را سبب میشود و بنابراین هدایت الکتریکی (conductance) سیستم نیز افزایش (مقاومت کاهش) می یابد.با منبع های تغذیه ولتاژ ثابت ، افزایش به وجود آمده در جریان هم مهاجرت پروتیین ها را افزایش میدهد و هم تبخیر آب از محیط پایه را .هر گونه از دست رفتن آب سبب افزایش در غلظت یونها شده و سبب کاهش بیشتر مقاومت (R) میگردد. در چنین شرایطی ، جریان و بنابراین سرعت مهاجرت بطور پیشرونده ای افزایش می یابد.برای کم کردن این اثر ها بهتر آن است که از یک منبع تغذیه با جریان ثابت بهره گرفته شود.

طبق قانون اهم (Ohm)

بنابراین اگر R کاهش یابد نیروی حرکت دهنده الکتریکی (EMF) نیز کاهش می یابد با ثابت نگه داشتن جریان،اثر گرما کاهش می یابد و سرعت مهاجرت پایدار باقی می ماند.

در ایزوالکتریک فوکوزینگ (isoelectric focusing = IEF) یک منبع تغذیه که یک توان ثابت را فراهم میکند بهتر است.در طی الکتروفورز ، به میزان قابل توجهی جریان افت میکند، چون همینکه امفولیت ها در نقطه ایزوالکتریک خودشان تمرکز میکنند هدایت الکتریکی (conductivity) هم به این علت و هم بخاطر ایجاد ناحیه هایی با آب خالص، پایین میافتد.اگر یک منبع ولتاژ ثابت

بکار گرفته شود تنظیم های پی در پی ولتاژ ممکن است لازم باشد. در نتیجه منبع های تغذیه جریان ثابت در ایزوالکتریک فوکوزینگ بکاربرده نمیشوند. تکنیک های توان پالسی (pulsed-power) یا میدان پالسی (pulsed-field) نیازمند منبع های تغذیه ای هستند که به شکل دوره ای (periodically) ، سوی میدان الکتریکی نسبت به جهت مهاجرت مولکولها تغییر میکند.

 

بافرها (buffers)

یونهای بافر به دو منظور در الکتروفورز بکار گرفته میشوند: آنها حامل جریان الکتریکی هستند و دیگر اینکه pH را در نقطه ای که الکتروفورز انجام میشود تنظیم میکنند.بنابراین آنها 1) نوع بار الکتریکی روی ماده حل شونده  2) وسعت یونیزه شدگی ماده حل شونده و بنابراین  3) الکترودی که ماده حل شونده به سوی آنها مهاجرت خواهند کرد را تعیین میکنند.قدرت یونی (ionic strength) بافر، ضخامت ابر یونی (یون های بافر و یونهای غیر بافر) در برگیرنده مولکولهای باردار ، میزان مهاجرت آنها و شفافیت (sharpness) ناحیه های الکتروفورزی را تعیین میکند. با افزایش غلظت یونها، اندازه ابر یونی نیز افزایش یافته و مانع حرکت مولکولها میشود.برای جداسازی پروتیین های سرم بافر باربیتال یا بافر تریس-بوریک اسید اتیلن دی امین تترااستیک اسید (tris-boric acid EDTA) دوست داشتنی ترین بافرها به شمار میروند.

طبق قانون ژول (Joule) توان (power) ایجاد شده هنگامی که جریان (current) از میان یک محیط دارای مقاومت می گذرد به شکل گرما پراکنده میشود.این افزایش دما در رابطه مستقیم با میزان مقاومت و در تناسب با مربع جریان (I^2) است.کاهش در مقاومت که با قدرت یونی بالای بافر ایجاد میشود سبب افزایش جریان و گرمای بیش از اندازه میشود.این بافرها باندهای شفاف تری در جداسازی ها ایجاد میکنند اما مزیت این جداسازی شفاف با اثر ژول (گرما) کاسته میشود چرا که سبب دناتوراسیون (denaturation) پروتیین های ناپایدار در برابر گرما ویا تخریب دیگر اجزا میشود.

قدرت یونی ( که با نماد µ نیز نمایش داده میشود) با فرمول زیر حساب میشود.

که در آن

Ci = غلظت یون به مول در لیتر (mol/L)

Zi = بار یون

قدرت یونی µ برای یک الکترولیت (بافر) که از یونهای یک ظرفیتی(monovalent) تشکیل شده است برابر با مولاریتی (mol/L) آن است.قدرت یونی µ برای یک محلول الکترولیت 1 – mol/L دارای یک یون یک ظرفیتی و یک یون دو ظرفیتی (divalent) برابر با 3 mol/L است و برای الکترولیت تشکیل شده از دو یون دو ظرفیتی برابر با 4 mol/L است.

بکارگیری یک بافر با قدرت یونی بالا در الکتروفورز با توان جدا سازی بالا (high-resolution electrophoresis) جداسازی پروتیین های سرم را تا 13 باند با 2 یا چند باند در ناحیه α1 ، α2 و β-گلوبولین و یک یا چند باند بیشتر در جالتهای پاتولوژیک دیده میشود.بخاطر هدایت بالا و گرمای ایجاد شده لازم است که دمای سیستم به 10 تا 14 درجه سانتی گراد کاهش یابد. تکنیک های زیر دریایی (submarine techniques) که در آن ژل ها در یک بافر چرخان که به وسیله یک دستگاه سرد کننده بیرونی خنک میشود و یا در اتاقک الکتروفورزی جای داده شود که به وسیله آب چرخان خنک میشود سبب کنترل دقیق دما شده است.

از آنجایی که بافرهای الکتروفورز محیط های کشت خوبی برای باکتری ها هستند بنابراین هنگام استفاده نکردن از آنها در یخچال نگه داری شوند.دیگر اینکه بکاربردن یک بافر سرد در یک الکتروفورز بهتر است چرا که سبب جداسازی بهتر و کاهش تبخیر از محیط الکتروفورزی میشود.بافرهایی که در دستگاه های الکتروفورزی با حجم کم بکار میروند پس از کار باید دور ریخته شوند چون تغییر pH در بافر به خاطر الکترولیز آب طی الکتروفورز رخ میدهد.اگر حجم های بکار رفته بیشتر از 100 mL می باشد، بافر هر دو مخزن را میتوان با هم مخلوظ کرد و تا چهار بار دیگر بکار برد.

 

محیط های پایه (support media)

محیط پایه ماتریکسی را فراهم میکند که جداسازی پروتیین ها در آن انجام میشود.انواع مختلفی از محیطهای پایه در الکتروفورز بکار رفته اند، از محلول بافر خالص در یک کاپیلاری گرفته تا ژل های غیر محلول ( مانند کاغذ،و یا ستون هایی از نشاسته،اگاروز یا پلی اکریل امید) یا غشا هایی از سلولوز استات.ژل ها در محلولی با بافر یکسان با بافر روش الکتروفورزی انداخته شده و ممکن است در جهت افقی یا عمودی استفاده شوند.در هر صورت،بیشترین جداسازی (maximum resolution) هنگامی بدست میاید که نمونه در یک ناحیه بسیار نزدیک به نقطه شروع بکار گرفته شوند.جداسازی بر پایه اختلاف در نسبت بار به جرم (charge to mass ratio) پروتیین ها است و بستگی به اندازه روزنه های محیط و شاید اندازه مولکولی آنها دارد.

ژل نشاسته (starch gel)

ژل نشاسته اولین محیط ژلی بود که در الکتروفورز بکار برده شد و تنها علاقه تاریخی به آن وجود دارد.پروتیین ها را هم بر پایه اختلاف در نسبت بار به جرم و هم بر پایه اندازه مولکولی آنها جدا میکند.و بخاطر اینکه پروتیین ها در سطح  ژل قبل از مهاجرت  فشرده میشوند، این ژل ها باندهایی بسیار باریک با جداسازی خوب ایجاد میکنند.

 

سلولوز استات (cellulose acetate)

غشای سلولوز استات وقتی خشک است دارای 80 درصد فضای خالی بین رشته های به هم قفل شده خود داشته و یک فیلمی تار (opaque) و ترد و شکننده به شمار میرود.اما همینکه در بافر خیسانده میشود فضای هوا از مایع پر میشوند و غشا نرم و خم پذیر میشود. از آنجایی که غشای سلولوز استات تار است، غشاهای رنگ شده می بایست با خیساندن در متانول : استیک اسید گلاسیال (95:5) برای دانسیتومتری شفاف (transparent) شوند.غشاهای شفاف شده بسیار قوی بوده و میتوان آنها را برای همیشه نگه داری کرد، اما بخاطر خیساندن و شفاف سازی ، سلولوز استات با ژل اگاروز بطو گسترده ای در کاربردهای بالینی جایگزین شده است.

 

اگاروز (agarose)

اگاروز یک بسپار (polymer) خطی است که منومرهای D-galactose   و 3,6-anhydro-L-galactose دارد. اگاروز خالص شده بخش خنثی اگار است که از اگاروپکتین (agaropectin) یک بخش بسیار دارای بار و تشکیل شده از سولفات اسیدی و گروه های جانبی کربوکسیلیک بدست میاید. از آنجایی که اندازه روزنه های ژل اگاروز به اندازه کافی بزرگ است که همه پروتیین ها میتوانند از میان روزنه های آن بدون هیچ مانعی گذر کنند بنابراین جداسازی در آن تنها بر پایه نسبت بار به جرم پروتیین است.برتری های ژل اگاروز میل کم آنها به پروتیین ها و شفافیت آنها پس از خشک شدن است که یک دانسیتومتری بسیار عالی را فراهم میکند. ژل اگاروز بطور کامل تهی از گروه های یونیزه شونده بوده و بنابراین پدیده اندوسموز کمی را نشان میدهد.

 

ژل پلی اکریلامید (polyacrylamide gel)

پلی اکریلامید یک ماتریکس پلیمری است دارای زنجیرهای خطی از اکریلامید که با بیس-اکریلامید اتصال متقاطع دارد. بسیار پایدار در برابر حرارت ، شفاف ، مقاوم و از نظر شیمیایی خنثی است و بسته به غلظت بکار رفته در بازه گسترده ای از اندازه روزنه ها میتوان آن را ساخت .میانگین اندازه روزنه ها در یک ژل با غلظت 7.5% در حدود 5 nm است که به اندازه کافی برای مهاجرت بدون مانع پروتیین ها بزرگ است. اما از این روزنه ها (5 nm ) شماری از پروتیین ها مانند 1) فیبرینوژن  2) بتا-لیپوپروتیین  3) الفا دو – ماکروگلوبولین  4) گاما- گلوبولین ها نمیتوانند بگذرند. بنابراین جداسازی هم بر پایه نسبت بار به جرم است و هم اندازه مولکولی است ( این پدیده غربال مولکولی نامیده میشود) و پروتیین های سرم به بخش های جداگانه بیشتری نسب به ژل اگاروز تفکیک میشوند. دیگر اینکه این ژل ها بدون بار بوده و بنابراین الکترواندوسموز را حذف میکنند. مینی ژل های از پیش ساخته شده با غلظتهای مختلف و نسبتهای مختلف اکریلامید به بیس-اکریلامید برای جداسازی بیشتر پروتیین ها و اسیدهای نوکلئیک در دسترس است.از آنجایی که اکریلامید در ذات یک سرطانزا به شمار میرود ، احتیاط های لازم هنگام  ساخت دستی ژل باید انجام شود.

کوشش هایی در بهبود ماهیت هیدروفیلی (آب دوستی ) پلی اکریلامید منجر به ساخت گروه های جایگزین هیدورفیل مانند N-acryloyl-tris(hydroxymethyl) aminomethane یا همان poly NAT شده است.این مواد نسبت به پلی اکریلامید بیشتر هیدروفیل بوده و ماتریکس آنها روزنه های بزرگتری داشته و مقاومت کمتری در برابر گذر مولکولهای بزرگ ایجاد میکنند.این پلی اکریلامید های بهبود یافته برای جداسازی قطعه های DNA تا 20 kb در یک میدان الکتریکی بدون پالس مناسب هستند.

 

سیستم های خودکار (automated systems)

به دلیل حجم زیاد آزمایش ها به ویژه در مورد پروتیین ها ، آزمایشگاه ها از سیستم های خودکار بهره میگیرند.این سیستم ها از 10 تا 100 نمونه را همزمان انالیز میکنند. ویژگی های این سیستم های خودکار شامل 1) بکارگیری بر خط نمونه ها  2) جداسازی خودکار الکتروفورزی و رنگ آمیزی انالیت ها  3) توانایی چند رنگ امیزی (multiple staining)  4) شناسایی نمونه های مثبت 5) الکتروفورز در دمای کنترل شده 6) دانسیتومتری همزمان چند نمونه میباشد.

 

روند عمومی الکتروفورز (general operations)

روند عمومی الکتروفورز که در یک الکتروفورز معمولی انجام میشود شامل 1) جداسازی (separation)  2) آشکارسازی (detection)  3) اندازه گیری (quantification)  و 4) تکنیکهای خشک کردن

 

جداسازی الکتروفورزی (electrophoretic separation)

روند الکتروفورز به این صورت است که 1) بافر اضافی از سطح محیط از پیش خیسانده شده در بافر با خشک کردن آن برداشته میشود ، هیچ حبابی هوایی نباید بر جای بماند 2) 5 تا 7 میکرولیتر از نمونه به وسیله یک شانه پلاستیکی یا چیزی مانند آن جاگذاری میشود و اجازه داده میشود تا نمونه در درون ژل منتشر شود سپس خشک میکنند تا اضافی ها برداشته شوند. 3) ژل در درون اتاقک الکترود قرار داده میشود. 4) الکتروفورز با جریان ، ولتاژ یا توان از پیش تعیین شده انجام میشود. 5) ژل آبکشی شده ، فیکس میشود و سپس خشک میگردد 6) ژل را رنگ آمیزی میکنند و دوباره خشک میکنند 7) ژل در یک دانسیتومتر اسکن میشود. اگر قرار است که ایزوانزیم ها آشکار سازی شوند محلول رنگ سوبسترا در ژل اینکوبه میشود تا پیش از فیکس کردن و خشک کردن رنگ آمیزی انجام شود.

 

آشکار سازی و اندازه گیری (detection and quantification)

همینکه جداسازی انجام شد ، پروتیین ها را با رنگ آمیزی و به دنبال آن اندازه گیری با یک دانسیتومتر و یا با اندازه گیری مستقیم با بکارگیری یک سیستم آشکارسازی نوری تنظیم شده در طول موج 210 nm تشخیص میدهند.

 

رنگ آمیزی (staining)

اگر قرار است برای دیدن پروتیین های جداشده رنگ آمیزی انجام شود، پروتیین ها را اول با یک عامل شیمیایی مانند استیک اسید یا متانول پرسیپیته (precipitate) و فیکس میکنند.با این کار از انتشار پروتیین ها به بیرون از ژل در هنگامی که در محلول رنگ غوطه ور میکنند پیشگیری میکند.مقدار رنگی که به وسیله نمونه برداشت میشود به عامل های زیادی بستگی دارد مانند نوع پروتیین و درجه دناتوراسیون پروتیین ها به وسیله عامل های فیکس کننده .

جدول 12-1 رنگ هایی را که بطور معمول در الکتروفورز بکار برده میشوند به همراه طول موج های پیشنهادی برای اندازه گیری با دانسیتومتر فهرست کرده است.بیشتر روشهای تجاری برای الکتروفورز پروتیین های سرم amido black B یا عضوی از سری رنگهای coomassie brilliant blue را بکار میبرند.ایزوانزیم ها را میتوان با اینکوبه کردن ژل در تماس با یک محلول سوبسترا که بطور ساختاری یا شیمیایی به یک رنگ متصل شده است دید و سپس آنها را فیکس میکنند. نیترات نقره (silver nitrate) و سیلور دی امین (silver dimmine) پروتیین ها و پلی پپتیدها را با حساسیت 10 تا 100 برابر بیشتر از رنگهای معمول رنگ میکنند.

فیکس کردن گزینشی و رنگ آمیزی گزینشی زیر کلاس های پروتیین ها را میتوان با ترکیب یک مولکول رنگ با یک انتی گلوبولین همانند آنچه که در ایمونوفیکساسیون (immunofixation) رخ میدهد انجام داد.

بهبود اندازه گیری ها به سوی اندازه گیری های حساس تر با اتصال یک انزیم مانند الکالین فسفاتاز یا پراکسیداز به یک انتی بادی به تنهایی (primary antibody) یا یا به انتی بادی دوم (secondary antibody) که اختصاصی برای پروتیین هایی ویژه است به این روش و نیز با روش افشاندن پروتیین های جدا شده با لومینال (luminal) و پراکسید (peroxide) برای ایجاد یک واکنش کمی لومینسانس و ثبت همیشگی واکنش روی یک فیلم X-ray به دست آمده است.

در عمل یک محلول رنگ طبیعی ممکن است چندین بار استفاده شود پیش از اینکه دور ریخته شود . یک حساب سر انگشتی نشان میدهد که یک محلول رنگ 100 mL برای 387 cm^2 از فیلم اگاروز میتواند بکار برده شود. اگر ناحیه های پروتیینی رنگ شده با محلول شستشوی اسید استیک 5% ، شسته و زدوده شوند آنگاه رنگ ناکارامد در نظر گرفته میشود و باید کنار گذاشته شود. هرگاه ناحیه های پروتیینی خیلی روشن رنگ گرفته باشند باید به عملکرد رنگ یا سوبسترا ( در مورد ایزوانزیم ها ) شک کرد.محلول رنگ ها را باید بسیار محکم بست تا تبخیر نشوند.

 

اندازه گیری (quantification)

از دانسیتومتر (densitometer) برای اندازه گیری ناحیه های رنگ شده استفاده میکنند.این دستگاه ، هنگامی که ژل از یک سیستم نوری فوتومتری میگذرد جذب هر بخش را اندازه گیری میکند و الکتروفروگرام (electropherogram) را روی یک ثبت کننده نمودار یا صفحه نمایش یک کامپیوتر نشان میدهد.بخش های دارای ریزپردازنده بطور خودکار سطح زیر هر پیک (قله ) را حساب کرده و بصورت درصدی از کل یا بصورت غلظت مطلق از کل پروتیین یا فعالیت مطلق از کل فعالیت انزیمی در نمونه گزارش میکند.

اندازه گیری دانسیتومتری قابل اعتماد بستگی به 1) نور با طول موج مناسب  2) پاسخ خطی ( linearity) دستگاه  3) پس زمینه شفاف محیطی که اسکن میشود ، دارد. خطی بودن (linearity) دستگاه با فیلترهای دانسیتی خنثی (neutral density filter) که یا جدا از هم یا دارای ناحیه هایی از دانسیتی افزایش یابنده بطور خطی هستند ، آزمایش میشوند. این دانسیتی (density) ها همیشگی بوده و دارای مقدارهای جذبی مورد انتظار هستند.اندازه بسیار کمی از نمونه بکار گرفته میشود و شفافیت ژل اگاروز هم برای داشتن یک پس زمینه شفاف فراهم میشود. با این حال مشکلاتی در رابطه با دانسیتومتر بخاطر اختلاف در مقدار رنگ برداشت شده به وسیله پروتیین ها و اختلاف در اندازه ناحیه پروتیینی رخ میدهد.

ویژگی های ضروری یک دانسیتومتر شامل 1) توانایی اسکن کردن ژل ها با 25 ت 100 میلی متر درازا. 2) دارای تنظیم الکترونیکی برای در نظر گرفتن شدیدترین پیک به عنوان مقیاس کامل (full scale)  3) صفر نمودن خودکار پس زمینه  4) کنترل طول موج در گسترهnm  400 تا 700 nm  5) دارای روزنه های متغیر برای تنظیم اندازه پرتو نور  6) وجود بخشی که بطور خودکار یا دستی میان پیک ها برش ایجاد میکند 7) مرتب کننده خودکار ، ویژگی ای که نوار الکتروفورزی را از یک کانال نمونه به کانال نمونه بعدی پیش میبرد. از ویژگی های دلخواه دیگر برای یک دانسیتومتر توانایی گزینش چند سرعت برای اسکن کردن و توانایی اندازه گیری در حالت بازتابش (reflectance mode) است.

 

تکنیک های خشک کردن (blotting techniques)

در سال 1975 ادوارد ساترن (Edward southern) تکنیکی را طراحی کرد که بطور گسترده ای در تشخیص قطعه های DNA (DNA fragments) بکار رفت .این تکنیک ساترن بلاتینگ (southern blotting) نام دارد که اول باید الکتروفورز DNA یا قطعه های DNA در ژل اگاروز انجام شود و سپس یک نوار نیتروسلولوز (nitrocellulose) یا یک غشای نایلونی (nylone membrane) روی ژل اگاروز خوابانده میشود و DNA یا قطعه های DNA به روی آن به روشهای کاپیلاری بلاتینگ (capillary blotting) ، الکتروبلاتینگ (electro-blotting) یا وکیوم بلاتینگ (vacuum blotting) منتقل (transferred) یا خشک (blotted) میشوند.آنگاه این DNA یا قطعه های DNA با هیبریدیزاسیون (hybridization) با یک پروب (probe) نوکلئیک اسید مکمل (complementary) نشاندار آشکارسازی شده و شناسایی میشود. از این تکنیک بطور گسترده ای در 1) زیست شناسی مولکولی برای شناسایی توالی ویژه ای از DNA  2) تعیین وجود، جایگاه ، و شمار نسخه های (copy) یک ژن در یک ژنوم و  3) تعیین نوع DNA (DNA typing) استفاده شده است.

تکنیک های نورترن بلاتینگ (northern blotting) و وسترن بلاتینگ (western blotting) به منظور تشابه با ساترن بلاتینگ درباره جداسازی و آشکارسازی ریبونوکلئیک اسید (RNAs) ها و پروتیین ها به ترتیب نامگذاری و طراحی شدند. نورترن بلاتینگ بطور یکسان با ساترن بلاتینگ انجام میشود بجز اینکه یک پروب RNA نشاندار برای هیبریدیزاسیون بکار برده میشود.از وسترن بلاتینگ برای جداسازی ، آشکارسازی و شناسایی یک یا چند پروتیین در یک مخلوط پیچیده استفاده میشود. وسترن بلاتینگ شامل جداسازی پروتیین ها در ژل پلی اکریلامید و سپس انتقال یا بلاتینگ روی یک نوار خوابانده شد از جنس نیتروسلولوز یا یک غشای نایلونی به وسیله روش الکترو-بلاتینگ است. نوار یا غشا آنگاه با یک ریاجنتی که دارای انتی بادی ضد پروتیین مورد جستجو است واکنش داده میشود.

 

نظرداشت های تکنیکی و عملی (technical and practical considerations)

در جداسازی الکتروفورزی چند جنبه تکنیکی و عملی لازم است که در نظر گرفته شود.

 

نمونه برداری (sampling)

برای دست یافتن به یک تعادل میان اندازه گیری حساس (sensitive measurement) و جداسازی شفاف (resolution) مقدار پروتیین سرمی بکار رفته در یک محیط الکتروفورزی باید مناسب باشد. البومین در حدود 10 برابر غلیظ تر از کمترین بخش پروتیینی سرم یعنی α1 – گلوبولین ها است.بنابراین مقدار سرم بکار رفته باید از پربار (overloading) شدن با البومین جلوگیری کند اما باید به اندازه ای کافی باشد که بتون α1 –گلوبولین ها را شناسایی و اندازه گیری کرد.برای جداسازی پروتیین های سرم با الکتروفورز در ژل پلی اکریلامید (PAGE) ، 3 uL از سرم که دارای تقریبا 210 ug پروتیین است بکار برده میشود.برای ایزوانزیم های الکالین فسفاتاز تا 25 uL از یک سرم نرمال ( اگر فعالیت انزیم بسیار افزایش یافته بود باید کمتر برداشته شود) بکار برده میشود.نمونه های ادرار نیازمند 50 تا 100 برابر غلیظ تر یا زمان های انجام الکتروفورزی زیادتری برای رسیدن به یک حساسیت کافی میباشند.CSF ممکن است نیازمند تغلیظ باشد یا نباشد بستگی به روش رنگ آمیزی بکار رفته دارد.

 

ناپیوستگی در نمونه گذاری (discontinuities in sample application)

ناپیوستگی در نمونه گذاری ممکن است بخاطر 1) اپلیکاتور کثیف  2) آلودگی های ناخواسته به وسیله شانه نمونه گذاری  3) وجود حباب هوا اگر نمونه به درون ژل پی پت شود.

 

سرعت های مهاجرت نایکسان (unequal migaration rates)

سرعت های مهاجرت نایکسان در پهنای ژل ممن است بخاطر کثیف بودن الکترودها باشد که سبب ایجاد یک میدان الکتریکی غیر یکنواخت میشود یا ممکن است ناشی از غیر یکنواختی مرطوب شدن ژل باشد.اگر فیتیله ها (wicks) برای اتصال ژل به منبع تغذیه بکار رفته باشد ، مرطوب بودن غیر یکنواخت فیتیله ها سبب مهاجرت نایکسان خطهای نمونه در لبه های ژل میشود.

 

باندهای بدشکل ، غیرمعمول یا غیر طبیعی (distorted,پunusual or atypical bands)

ناحیه های پروتیینی بدشکل ممکن است بخاطر اپلیکاتورهای بسیار کج ،وجود حباب هوا طی نمونه گذاری ، نمونه گذاری بیش از اندازه یا خشک کردن  ناکافی نمونه ایجاد شود.ناحیه های بد شکل ممکن است بخاطر خشک کردن بیش از اندازه محیط الکتروفورز پیش یا طی الکتروفورز باشد.بی نظمی ها ( غیر از ناحیه های شکسته شده ) در نمونه گذاری ممکن است بخاطر مرطوب شدن بیش از اندازه ژل اگاروز باشد.

در بیشتر موارد باندهای غیر معمول، ارتیفکت (artifact) ها هستند که به آسانی شناخته میشوند. نمونه های همولیز شده (دارای گلبولهای سرخ لیز شده ) علت عمده بتا-گلوبولین افزایش یافته ( جایی که هموگلوبین مهاجرت میکند) است و یا باند غیرمعمول میان آلفا دو و بتا –گلوبولین ها بخاطر کمپلکس های هموگلوبین – هاپتوگلوبین است.یک باند در نقطه آغازین یک الکتروفروگرام مربوط به فیبرینوژن است . الفا و بتا – لیپوپروتیین ها ممکن است در شماری از نمونه ها جلوتر از جایگاه همیشگی شان مهاجرت کنند.گاه گاهی یک ناحیه البومین جدا در مورد بسیار کمیاب ، خوش خیم و ژنتیکی بیس – البومینمی (bis-albuminemia) دیده شود. با این حال یک ناحیه البومین بسیار پهن می تواند بخاطر داروهای متصل به البومین باشد و نه بخاطر اشکال در الکتروفورز.

باندهای غیر طبیعی (atypical bands) در یک الگوی ایزوانزیم ممکن است بخاطر اتصال یک ایمونوگلوبولین (ماکروانزیم ) که سبب مهاجرت غیر طبیعی یک یا چند ایزوانزیم نرمال و طبیعی میشود باشد. گاهی ، یک ناحیه پروتیینی بی نظم ولی بسیار شفاف در نقطه اغازین دیده میشود . برخلاف فیبرینوژن یا دیگر پروتیین ها که در این نقطه ممکن است دیده شوند، ارتیفکتهایی که نمایی بی نظم و تا حدی متمرکز (یاند پروتیین ها نمایی منظم و تا حدی پراکنده دارند ) از خود نشان میدهند نیز در این نقطه دیده میشوند ، در این نقطه اغازین پروتیین های دناتوره شده ناشی از سرم کهنه نیز ممکن است دیده شوند.هنگام روبرو شدن با یک باند غیرمعمول در هر جایی از الگوی پروتیین سرم احتمال یک پاراپروتیین (paraprotein)واقعی باید در نظر گرفته شود. و در پایان اینکه یک روند آزمایشگاهی خوب (good laboratory practice) خواهد بود اگر یک سرم کنترل را در هر بار انجام الکتروفورز برای ارزیابی کیفیت سرم و نیز ارزیابی کیفیت دانسیتومتر بکار برد.

 

 

انواع الکتروفورز (types of electrophoresis)

با محیطهای مختلف در قالبهای فیزیکی مختلف و شماری پیکربندی های مختلف ، چندین نوع از تکنیکهای الکتروفورزی را برای جداسازی گستره گوناگونی از انالیت ها میتوان بکار گرفت.

 

Slab gel electrophoresis

روشهای سنتی با استفاده از ژل مستطیل شکل جدای از ضخامت را بطور دسته جمعی slab gel electrophoresis می نامند.اصلی ترین مزیت آن توانایی در جداسازی همزمان چند نمونه در یک بار کاری است. محیطهای نشاسته ، اگاروز و پلی اکریلامید همه در این چارچوب استفاده شده اند. این نوع الکتروفورز اصلی ترین روش در آزمایشگاه شیمی بالینی برای جداسازی کلاس های مختلف پروتیین های سرم یا CSF و DNA و قطعه های DNA است.

Slab gel ها ممکن است با افزودنی هایی آغشته شوند مانند  1) امفولیت ها که یک شیب pH ایجاد میکنند ( بخش ایزوالکتریک فوکوزینگ را ببینید )  یا 2) سدیم دو دسیل سولفات (SDS) که پروتیین ها را دناتوره میکند { الکتروفورز دو بعدی (tow-dimentional (2D) electrophoresis را ببینید } . در شماری از کاربری ها یک شیب غلظت یا دناتوره کننده در ژل  ایجاد میشود تا جداسازی بهتر انجام شود. ژلهای بسیار نازک با یا بدون شیب غلظتی کارامدی سرعت جداسازی قطعه های DNA را بهبود بخشیده اند.علاوه بر جداسازی پروتیین های سرم، الکتروفورز در جداسازی ایزوانزیم ها ،لیپوپروتیین ها ، هموگلوبین ها و قطعه های DNA و RNA بکار میرود.جداسازی یک بعدی DNA و RNA بطور معمول همیشه همراه با اضافه کردن یک مخلوطی است دارای شاخص های اندازه قطعه (fragment size markers) و به نام نردبان (ladder) در یک خط (lane) برای مشخص کردن اندازه قطعه ها در نمونه .

 

دیسک الکتروفورز (disc electrophoresis)

الکتروفورز پروتیین در ژل اگاروز تنها پنج ناحیه به نام های 1) البومین  2) الفا یک -  3) الفا دو -  4) بتا -  5) و گاما-گلوبولین ها است ، اگر چه چند زیربخش (subfractionation) در الفا دو و بتا-گلوبولین ها ممکن است در ژل های با توان جداسازی بالا (high-resolution) دیده شود. دیسک الکتروفورز اول بار به وسیله Davis and Ornstein نواوری شد و نام آن از Discontinuities (ناپیوستگی ) در ماتریکس الکتروفورزی گرفته شده که این ناپیوستگی با لایه هایی از ژل پلی اکریلامید یا نشاسته که در محتوا (composition) و اندازه روزنه (pore size) ها فرق میکنند ،در ژل ایجاد میشود.این ژل ها ممکن است 20 بخش (fraction) یا بیشتر ایجاد کنند و در بررسی پروتیین های سرم به ویژه واریانت(گونه ) های ژنتیکی و ایزوانزیم ها بطور گسترده ای بکار رفته است.

در این تکنیک نمونه ها در یک سیستمی با سه ژل که در آزمایشگاه ساخته میشود ، جداسازی میشوند.این سیستم از یک ژل جداسازی با روزنه های کوچک (small-pore separation gel) و به دنبال آن یک قطعه نازک به نام ژل فاصله دهنده با روزنه های بزرگ (large-pore spacer gel) و سپس یک لایه نازک از محلول منومر با روزنه های بزرگ (large-pore monomer solution) که محتوی مقدار کمی سرم ( به اندازه 3 میکرولیتر) در یک لوله شیشه ای با دو انتهای باز (open-ended glass tube) ساخته شده است.این فرایند توان جداسازی (resolution) را بهبود بخشیده است طوری که تغلیظ مایع های رقیق از پروتیین مانند CSF ضروری نمی باشد.نمایی از الکتورفورز پروتیین سرم با این روش در شکل 12-3 نشان داده شده است.

 

 

 

 

 

 

منبع:تیتز پایه های شیمی بالینی و تشخیصهای مولکولی،ویرایش پنجم،فصل دوازدهم

,Tietz; textbook of clinical chemistry and  molecular diagnostics ,fifth edition,chapter12