طیف سنجی نور (spectrophotometry) - بخش اول

طیف سنجی نور (spectrophotometry) - بخش اول

 

اسپکتروفتومتری (spectrophotometry) 

فوتومتری به عنوان اندازه گیری نور تعریف میشود و اسپکتروفوتومتری به عنوان اندازه گیری شدت نور در طول موجهای انتخابی تعریف میشود.انالیزهای اسپکتروفوتومتری بصورتهای کمی و کیفی بطور وسیع در علوم زیستی و شیمیایی استفاده میشود ، این متد وابسته به ویژگی های جذب نوری ماده یا مشتقات ماده مورد انالیز دارد.شدت نور عبوری که از یک محلول حاوی یک ماده جذب کننده نور ( رنگزا = chromogen) عبور میکند با کم شدن بخش جذب شده ، کاهش می یابد. این کسر در شدت نور ، تشخیص داده شده ، اندازه گیری شده و برای ارتباط دادن نور عبوری یا جذب شده با غلظت انالیت مورد نظر ارتباط داده میشود .

 

مفاهیم پایه (basic concepts) 

یک پرتو نوری تصادفی را با شده Io  در نظر بگیرید که از یک محفظه مربعی شکل حاوی یک محلول از یک ترکیبی عبور میکند که نور را در یک طول موج معین λ جذب میکند. و فرض کنید که شدت پرتوی نور عبوری Is  است ، آنگاه  میزان عبور نور (transmittance = T)بصورت زیر تعریف میشود .

                                                                                T = Is / Io 

بخشی از نور برخوردی ممکن است توسط سطح محفظه یا سلول انعکاس یابد و یا ممکن است دیواره سلول یا محفظه حاوی نمونه و یا خود محلول جذب شود . برای تمرکز توجه روی ترکیب مورد علاقه حذف این عوامل ضروری است . با استفاده از یک سلول مرجع (محفظه مرجع ) که یکسان با سلول نمونه است بغیر از اینکه ترکیب مورد نظر از حلال درون آن حذف شده است ، میتوان این عوامل را حذف کرد. ترانسمیتانس (T) این سلول مرجع عبارت است از IR تقسیم بر Io ، ترانسمیتانس ترکیب مورد نظر در محلول پس به این صورت باز تعریف میشود که I تقسیم بر IR .

در عمل ابتدا پرتوی نور مسدود میشود و سپس یک سلول مرجع (کووت مرجع ) در دستگاه قرار داده میشود و سیگنال اشکار ساز (detector) روی 100 تنظیم میشود (که مطابق با میزان ترانسمیتانس 100 است) و در ادامه سلول حاوی نمونه قرار داده میشود تا اندازه گیری بصورت درصد نور عبوری انجام شود. همینطور که غلظت ترکیب را در محلول افزایش میدهیم درمی یابیم که ترانسمیتانس بطور معکوس و لگاریتمی در رابطه با غلظت تغییر میکند (شکل 10-2) .

بنابراین بهتر است که یک واژه دیگر را که راحت تر است به نام جذب (absorbance=A) را استفاده کنیم که بطور مستقیم با غلظت متناسب است .بنابراین مقدار نور جذب شده (A) طوری که نور تصادفی از یک نمونه گذر میکند طبق معادله زیر محاسبه میشود.

از نظر تحلیلی مقدار نور جذب شده یا عبور کرده بصورت ریاضی در ارتباط با غلظت انالیت مورد نظر طبق قانون بییر (Beer's law) بیان میشود.

 

قانون بییر - ارتباط بین ترانسمیتانس ، جذب و غلظت 

قانون بییر ( که به نام قانون بییر - لامبرت beer - lambert law نیز معروف است ) بیان میکند که غلظت یک ماده بصورت مستقیم متناسب است با مقدار نور جذب شده و یا بطور معکوس متناسب است با لگاریتم نور عبوری (جدول 10-2 را ببینید).بصورت ریاضی قانون بییر بصورت زیر بیان میشود.

                                                                                                    A= abc

که A عبارت است از میزان جذب 

a عبارت است از ثابت تناسب که به عنوان ثابت جذب (absorptivity) تعریف میشود

b طول مسیر نور که بصورت سانتی متر بیان میشود

c غلظت ترکیب دارای جذب نوری که معمولا بصورت مول در لیتر بیان میشود.

این معادله اساس اندازه گیری کمی به روش فوتومتری جذبی را تشکیل میدهد.وقتی که b برابر با 1 سانتی متر باشد و c بصورت مول در لیتر بیان شود آنگاه مقدار ثابت a مولار ابزورپتیویتی (جذب مولی = molar absorptivity) نامیده میشود. مقدار a یک مقدار ثابت است برای یک ترکیب در یک طول موج خاص تحت شرایط معین حلال ، دما ، pH ، و غیره (و اگر یک از این عوامل تغییر کند مقدار ثابت a نیز یک ثابت با مقدار جدید برای شرایط جدید تغییر می یابد).واژه نامه طیف سنجی (spectrophotometry) در جدول 10-2 خلاصه شده است.

مقادیر a برای تعیین ویژگی های ترکیبات و معین کردن میزان خلوص آنها و مقایسه میزان حساسیت اندازه گیری های بدست امده از مشتقات آنها بسیار کاربردی است .بیلی روبین خالص برای مثال وقتی که در کلروفرم در دمای 25 درجه سانتی گراد حل شود جذب مولی معادل 60700 در طول موج 453nm دارد . وزن مولکولی بیلی روبین برابر با 584 است .بنابراین محلولی حاوی 5 mg/L باید جذبی معادل 

                                                                                                                                         A= (60700) * (- 0.005 / 584 ) = 0.520

دارد. جدب مولی ترکیب آهن دوظرفیتی (ferrous Iron) و s- tripyridyltriazine معادل 22600 است در حالی که با phenanthroline برابر با 11000 است . بنابراین برای یک غلظت معین از آهن tripyridyltriazine  ترکیبی با یک جذب معادل دو برابر آنچه که کمپلکس با phenanthroline ایجاد میکند تولید میکند. بنابراین tripyridyltriazine یک ریاجنت بسیار حساستری در اندازه گیری آهن به حساب میاید.

 

کاربرد قانون بیر

در عمل، یک ارتباط کالیبر شده بین جذب و غلظت بصورت تجربی برای یک دستگاه مفروض تحت شرایطی معین با استفاده از یک سری محلولهای مرجع که حاوی غلظتهای افزایش یابنده از انالیت مورد نظر است ، برقرار می گردد. اغلب یک ارتباط خطی تا یک غلظت معین و یا تا یک جذب معین وجود دارد. تا وقتی که این ارتباط خطی وجود دارد گفته میشود که محلول تا این نقطه از قانون بییر پیروی میکند. در بین این محدوده یک ثابت کالیبراسیون (K) ممکن است برای محاسبه غلظت یک محلول مجهول در مقایسه با محلول های کالیبر کننده استفاده شود. از این ثابت K در شرایطی که جذب از قانون بیر پیروی نمیکند هرگز نباید استفاده شود. منحنی های کالیبراسیون غیر خطی به شرطی قابل استفاده هستند که تعداد کافی از کالیبراتور ها با غلظتهای متفاوت استفاده شود تا تمام محدوده خوانش مقدار مجهول را پوشش دهد.

بعضی از موارد نیز وجود دارد که یک ماده مرچع خالص به راحتی در دسترس نیست و این ثابتها را که با استفاده از مواد خالص بدست امده است را میتوان از نوشتار ها و مقالات علمی اخذ کرد. بطور کلی هنگام استفاده از این ثابتهای منتشر شده در نوشتارها باید در دقت داشت که روش انجام ازمایش کاملا از آنچه که در نوشتار امده پیروی میکند با جزییات کامل و خوانش نیز با طیف سنجی که قادر به تولید نور با خلوص طیفی بسیار بالا در طول موج مورد نظر است باید انجام شود.برای مثال از جذب نیکوتین امید ادنین دینوکلئوتید (NADH) در طول موج 340 nm بسیار فراوان به عنوان یک مرجع در اندازه گیری فعالیت انزیمی استفاده میشود (که دارای جذب مولی معادل 3^10 * 6.22 است ).استفاده از این جذب مولی تنها وقتی قابل قبول است که تمام شرایطی که در نوشتار ها منتشر شده است با تمام جزییات پیروی شده باشند.

 

1. قانون بیر تحت شرایط زیر قابل استفاده است 
2. تابش تصادفی نور به ماده مورد نظر باید تک رنگ ( تک طول موج ) باشد.
3. جذب حلال باید در مقایسه با جذب حل شوند غیرقابل ملاحظه باشد.
4. غلظت حل شونده باید در محدوده مورد نظر باشد.
5. مداخله گر نوری محلول وجود نداشته باشد.
6. واکنش شیمیایی بین مولکول مورد نظر با حل شونده دیگر یا مولکول حلال رخ ندهد.

 

دستگاهی کردن (instrumentation)

دستگاه های به روز ، گستره ای بسیار باریک از طول موج های یک طیف را برای اندازه گیری ها جدا میکنند. آنهایی که از فیلتر برای این منظور استفاده میکنند به نام فوتومترهای فیلتر دار خوانده میشوند و آنهایی که از پریزم (prism) یا گری تینگ (grating) استفاده میکنند اسپکتروفوتومتر (طیف سنج ) نامیده میشوند. طیف سنج ها به دو دسته طیف سنج های تک پرتویی(single beam spectrophotometer)  و طیف سنج های دو پرتویی (double beam spectrophotometer) تقسیم بندی میشوند.

 

 

منبع:تیتز پایه های شیمی بالینی و تشخیصهای مولکولی،ویرایش پنجم،فصل دهم

,Tietz; textbook of clinical chemistry and  molecular diagnostics ,fifth edition,chapter10