الکتروفورز (electrophoresis) - بخش دوم

الکتروفورز (electrophoresis) - بخش دوم

 

 

ایزوالکتریک فوکوسینگ الکتروفورز (isoelectric focusing electrophoresis)

ایزوالکتریک فوکوسینگ الکتروفورز ترکیبهای امفوتریک (amphoteric) مانند پروتیین ها را با توان جداسازی بالا در یک محیطی با شیب pH پایدار ، جدا میکند.پروتیین تا نقطه ای روی ژل مهاجرت میکند و در آن نقطه متمرکز (focused) میشود که pH ژل در آن نقطه با نقطه ایزوالکتریک (pH ی که بارهای مثبت با بارهای منفی روی مولکول باهم برابرند) پروتیین برابر است.در این نقطه بار پروتیین صفر است و مهاجرت آن متوقف میشود. شکل 12-4 روش انجام و شرایط الکتروفورزی را پیش و پس از برقراری جریان نشان میدهد.

 

بخاطر اینکه ناحیه مربوط به pH مورد نظر بسیار باریک (narrow) است ناحیه های پروتیین ،بسیار شفاف (sharp) هستند. با انتشار معمولی (ordinary diffusion) نیز به وسیله باردار شدن مولکول پروتیین مقابله میشود، همینکه پروتیین از نقطه ایزوالکتریک خود حرکت میکند دارای بار شده و دوباره به وسیله نیروهای الکتروفورزی به نقطه ایزوالکتریک خود باز میگردد( شکل 12-5( .پروتیین هایی که در نقطه ایزوالکتریک خود تنها به اندازه 0.02 واحد pH فرق دارند با ایزوالکتریک فوکوسینگ الکتروفورز جدا شده اند.

شیب pH با امفولیت های حامل (carrier ampholytes) ، گروهی از پلی امینو کربوکسیلیک اسیدهای امفوتریک (polyaminocarboxylic acids  amphoteric) ساخته میشوند که تفاوت بسیار کمی در ارزش pKa خود دارند و وزن مولکولی آنها بین 300 تا 1000 است.مخلوطی از 50 تا 100 ترکیب مختلف به محیط اضافه میشود و یک شیب pH طبیعی به هنگام رسیدن هر امفولیت به نقطه ایزوالکتریک خود طی الکتروفورز ، ایجاد میشود.این ها ناحیه های بافری بسیار باریک و بسیار پایدار ولی با تفاوت بسیار کم در pH ، ایجاد میکنند که از میان آنها پروتیین ها به آهستگی مهاجرت کرده و در نقطه ایزوالکتریک خودشان می ایستند.

همانطور که شکل 12-4 نشان میدهد آند با یک محلول اسیدی رقیق و کاتد با یک محلول قلیایی رقیق در بر گرفته شده است. بعد از تمرکز (focusing) ،امفولیت های حامل و پروتیین های بیشتر منفی در انتهای آند و آنهایی که بیشتر بار مثبت دارند نزدیک انتهای کاتدی ماتریکس الکتروفورزی یافت میشوند.دیگر امفولیت های حامل و پروتیین ها در نقطه های میانه مطابق با نقطه ایزوالکتریک خودشان تمرکز می یابند.از آنجایی که امفولیتهای حامل بطور کلی در غلظتهای بسیار بالا استفاده میشوند یک منبع تغذیه ولتاژ بالا (تا 2000 V) لازم است ( توان نزدیک به 2-50 W است ، بسته به شرایط آزمایش ). در نتیجه ماتریکس الکتروفورزی باید سرد شود. نوع اصلاح شده این تکنیک به نام (IPG-IEF) که در آن شیب pH بی حرکت شده (immobilized pH gradient = IPG) پیش از اینکه نمونه بکار برده شود ایجاد میشود. گزارش شده که این تکنیک اصلاح شده توان جداسازی و بازتولید (reproduceability) را بهبود بخشیده است.

PAGE-IEF به این خاطر که فاقد پدیده الکترواندوسموز است در کارهای انالیزی بسیار استفاده شده است.ژل پلی اکریلامید باید دارای روزنه هایی به اندازه کافی بزرگ باشد اما با این حال از مهاجرت پروتیین ها در اثر غربال مولکولی نباید جلوگیری شود. در عمل از مهاجرت نکردن شماری از پروتیین ها مانند IgM نمیتوان دور بود.AGE-IEF برتری هایی دارد از آنجمله اینکه شرایط آزمایش ساده است و اینکه بزرگی اندازه روزنه ها جدانشدن پروتیین ها بر پایه اندازه مولکولی را نامحتمل میکند.ایزوالکتریک فوکوسینگ الکتروفورز در جداسازی ایزوانزیم های الکالین فسفاتاز و در برنامه های غربالگری نوزادان جهت بررسی واریانت های هموگلوبین بطور گسترده بکار رفته است. تکنیکهای off-gel در محلول آزاد و با نمونه دارای امفولیت ها انجام میشود ، این نمونه در هر یک از سری چاهک (well) های خطی که با غشاهای نیمه تراوا (semipermeable) از هم جدا شده اند و در تماس با یک نوار شیب pH هستند ، بارگذاری میشوند و سپس الکتروفورز انجام میشود. الکتروفورز پروتیین های نمونه را در چاهکهای مختلف بسته به ارزش نقطه ایزوالکتریک آنها جدا میکند. بخش های جدا شده در گام فوکوسینگ دوم مشابه بیشتر جدا میشود و یا اینکه مستقیم ، برای جداسازی بیشتر به روش الکتروفورز دو بعدی (2D electrophoresis) یا روش کروماتوگرافی مایع-اسپکترومتری جرمی (liquid chromatography-mass spectrometry = LC-MS/MS) برداشت میشوند.این تکنیک در بررسی پروتئوم (proteome) انسان کاربرد دارد.

 

 

 

 

ایزوتاکوفورز (isotachophoresis)

ایزوتاکوفورز همه مواد یونی کوچکتر را در ناحیه هایی نزدیک به هم بدون همپوشانی ،همه آنهایی را که با سرعت یکسان حرکت میکنند ، جدا میکند.در این تکنیک الکترولیتهای پس زمینه (buffer) با نمونه مخلوط نمی شود و بنابراین همه جریان با یونهای باردار نمونه انجام میشود.بخش کوچکی از نمونه در یک کاپیلاری میان یک محلول الکترولیت پیشرو (leading) که دارای یون های با سرعت مهاجرت بالا نسبت به هر چیزی درون نمونه است و یک محلول دنباله (trailing) که دارای یون هایی با سرعت مهاجرت پایین تر نسبت به آنچه در نمونه است ، جاگذاری میشود.هنگامی که اجزای دارای سرعت بالا بطور کامل از اجزا با سرعت پایین جدا میشود یک ناحیه تهی از بار ایجاد میشود و مقاومت را افزایش میدهد و در نتیجه ولتاژ در آن ناحیه نیز بالا میرود.ولتاژ افزایش یافته سبب میشود که اجزای با سرعت آهسته سریعتر مهاجرت کنند و شکاف به وجود آمده را بپوشانند ، به این وسیله سبب غلیظ شدن آن و افزایش هدایت در ناحیه آن میشود تا اینکه به ناحیه یون های سریعتر برسد. در نهایت ، همه یون ها با سرعت سریعترین یون به سمت ناحیه (zone)هایی مهاجرت میکنند که این ناحیه (zone)ها متناسب با غلظت ابتدایی خود در اندازه فرق دارند.اندازه ناحیه به وسیله اندازه گیری جذب فرابنفش ، اختلاف دما یا هدایت طی گذر نمونه از یک آشکارساز تعیین میشود.کاربردهای این تکنیک در جداسازی همه آنیون ها و کاتیون ها ، اسیدهای آلی و اسیدهای امینه و پپتیدها ، نوکلئوتیدها ،نوکلئوزیدها و پروتیین ها کاربرد دارد.

 

الکتروفورز با میدان پالسی (pulsed-field electrophoresis)

در الکتروفورز با میدان پالسی ، توان (power) بطور دوره ای (alternately) برای جفت الکترودهای مختلف یا ردیفهای الکترودی مختلف بکار برده میشود و بنابراین میدان الکتروفورزی بین دو جهت می چرخد.جهت ها از نظر فضایی از 105 تا 180 درجه می توانند فرق کنند و مولکولها باید خودشان را با جهت میدان جدید ، پیش از اینکه به مهاجرت ادامه دهند در هر دوره (cycle) هم جهت کنند. از آنجایی که زمان جهت گیری دوباره (reorientation) بستگی به وزن مولکولی دارد ، بنابراین مهاجرت خالص (net migration) تابعی از فرکانس تغییر میدان خواهد بود.این تکنیک اجازه جداسازی مولکولهای بسیار بزرگ مانند قطعه های DNA که بزرگتر از 50 kb هستند و نمی توان آنها را با ژل های اگاروز یا پلی اکریلامید دارای روزنه های کوچک جدا کرد، میدهد. قطعه های 50 – 400 kb را میتوان با زمان پالس 10-s جدا کرد در حالی که قطعه های بزرگتر تا 7 مگا باز (7 mb) و یا حتی کروموزوم دست نخورده نیازمند زمان پالس چند ساعتی برای جداسازی کامل میباشند. این تکنیک برای تعیین نوع گونه های مختلف DNA باکتری ها در بررسی های تحقیقاتی و همه گیر شناسی بکار رفته است.

 

الکتروفورز دو بعدی (tow-dimensional(2D) electrophoresis)

الکتروفورز دو بعدی بطور گسترده ای در زمینه پروتئومیکس (proteomics) برای بررسی خانواده پروتیین ها و جستجو برای تفاوتهای ژنتیکی یا بیماری ها یا بررسی محتوای پروتیینی سلولهای مختلف بکار میرود.همچنین در بررسی جهش (mutation) های ژن انسان و DNA باکتریها و سلول های توموری مختلف به عنوان ابزاری برای شناسایی زودتر بکار گرفته شده است. با ترکیب ایزوالکتریک فوکوسینگ الکتروفورز وابسته به بار (charge-dependent IEF) در بعد اول (first dimention) به همراه الکتروفورز وابسته به وزن مولکولی (molecular weight-dependent electrophoresis) در بعد دوم، این تکنیک توان جداسازی تا 1100 نقطه پروتیینی با بکار گیری آشکارسازی اتورادیوگرافی و تا 400 تا با بکارگیری رنگهای کوماسی (coomassie dyes) را دارد.جداسازی بعد اول در محیطی با روزنه های بزرگ مانند ژل اگاروز یا ژل پلی اکریلامید با روزنه های بزرگ انجام میشود.بعد دوم بیشتر پلی اکریلامید است در یک چارچوب خطی (از نظر غلظت) یا شیب دار (از نظر غلظت) .

الکتروفورز دو بعدی معمولی از تکنیک PAGE-IEF در لوله هایی (tubes) با اندازه 130 در 2.5 میلی متر (قطر درونی لوله ) در بعد اول و در یک گسترده pH از 3 تا 10 استفاده میکند.پس از اینکه الکتروفورز انجام شد ،ژل را از لوله خارج میکنند و در تماس با یک برگ ژل (slab gel) نازک و دارای شیب (از نظر غلظت) پلی اکریلامید که SDS (sodium dodecylsulfate) در آن آغشته شده است قرار میدهند.در پایان فرایند پلی پپتیدها به وسیله یکی از چندین روش شناسایی میشوند.SDS بطور معمول در الکتروفورز بعد دوم بکار برده میشود چون با کاهش باندهای دی سولفیدی ،پروتیین ها آنها را دناتوره و دپلیمریزه میکند. هنگامی که پروتیین های دست نخورده مانند انزیم ها قرار است که بیشتر بررسی شوند فراورده های نمونه ای دناتوره نشده و شرایط الکتروفورزی ویژه ای باید بکار برده شود.

پروتیین های جداشده به وسیله رنگهای کوماسی ، رنگ امیزی نقره ، رادیوگرافی ( قرار دادن فیلم عکس برداری در برابر تابش های پلی پپتیدهای نشاندار شده با ایزوتوپ ها و یا به روش کمی لومینسانس ) ، یا انالیز فلوروگرافی ( قرار دادن فیلم تابش X در برابر پلی پپتیدهای نشاندار شده با تریتیوم (tritium) در حضور یک سینتیلاتور (scintillator) آشکار سازی میشوند.دو روش آخر حساس ترین روش ها هستند و 100 تا 1000 برابر حساس تر از رنگهای کوماسی می باشند.difference gel electrophoresis (DIGE) مقایسه دو نمونه را در یک ژل دو بعدی که هر یک با فلوروفور جداگانه ای نشاندار شده اند را فراهم میکند. اگر چه هر نقطه جداشده دارای پروتیین هایی است که در هر دو نمونه یافت میشود اما تحریک گزینشی (selective excitation) و نرم افزارهای اسکن کننده وجود اختلاف ها را بصورت کیفی مشخص میکند.

پیشرفت های جدیدتر در این زمینه تلاش میکند تا الکتروفورز دو بعدی را با اتصال ایزوالکتریک الکتروفورز فوکوسینگ مایع و کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (high-performance liquid chromatography)با محیط سیلیکای بدون روزنه و فاز معکوس و آشکار سازی پروتیین های دست نخورده به وسیله الکترواسپری یونیزاسیون (electrospray ionization) ، زمان پرواز (time of flight) و اسپکترومتری جرمی (mass spectrometry) انجام دهد.

 

الکتروفورز مویین (capillary electrophoresis)

با الکتروفورز مویین تکنیکهای 1) الکتروفورز ناحیه ای  2) ایزوتاکوفورز  3) ایزوالکتریک فوکوسینگ الکتروفورز  4) الکتروفورز در ژل در یک لوله مویین (با قطر درونی از 10 تا 100 میکرومتر) و دارای روزنه های کوچک از سیلیکای جوش خورده و به درازای 20 ت 200 سانتی متر انجام میشود.

دو برتری مشخص در این قالب مویین 1) توانایی بکاربردن ولتاژهای بسیار بالا نسبت به الکتروفورز های معمولی و  2) آسانی در خودکار کردن این تکنیک است. کاربردهای آن بسیار گسترده تر و شامل جداسازی یونهای با وزن مولکولی پایین علاوه بر پروتیین ها و دیگر ماکرومولکولها است.حتی مولکولهای بی بار را میتوان با الکتروفورز مویین در روش کروماتوگرافی الکتروکینتیک میسلی (micellar electrokinetic chromatography) جدا کرد.الکتروفورز مویین همچنین ثابت کرده که در جداسازی 1) یونهای غیر آلی  2) امینو اسیدها  3) اسیدهای آلی  4) داروها  5) ویتامین ها  6) پورفیرین ها  7) کربوهیدراتها  8) الیگونوکلئوتیدها  9) پروتیین ها  10) قطعه های DNA  توانمند بوده است.

 

دستگاهی کردن (instrumentation)

یک نمای طرحوار از پیکربندی دستگاهی یک الکتروفورز مویین معمولی در شکل 12-6 نشان داده شده است.همانطور که نشان داده شده است ، لوله مویین به عنوان یک اتاقک الکتروفورزی عمل میکند همانند یک مسیر در یک ژل که به مخزن هایی از بافر در هر دو پایانه متصل است و این دو پایانه بافری به یک منبع تغذیه با ولتاژ بسیار بالا وصل شده است.

شایان ذکر است که در شماری از نقاط در طول لوله مویین (معمولا نزدیک به انتها ) یک آشکارساز برای آشکارسازی برخط (online detection)، مرتبط شده است.رها سازی بهبود یافته گرمای ایجاد شده از لوله مویین (برخلاف slab gel) اجازه بکاربردن ولتاژ در گستره 10 تا 30 کیلوولت را میدهد که سبب افزایش کارایی جداسازی و کاهش زمان جداسازی حتی تا کمتر از 1 دقیقه میشود.تنها چند میکرولیتر از نمونه لازم است این مقدار کم از نمونه آشفتگی ایجاد شونده به وسیله انالیتها و دیگر گونه های موجود در نمونه بر میدان بکار رفته را کاهش میدهد.

برخلاف کار پرزحمت و زمان بر در الکتروفورزهای معمولی ، الکتروفورز مویین به سادگی میتوان آنرا همانند HPLC خودکار کرد، نمونه ها در یک محیط کنترل شده از نظر دما نگه داری شده ، بطور خودکار به درون لوله مویین تزریق میشوند و با انواع مختلفی از آشکارسازها ،آشکارسازی شده و الکتروفروگرام های بدست آمده  به همان روش کروماتوگرام ها پردازش و دستکاری میشوند.

 

چارچوب لوله مویین (the capillary format)

مویینه های بکار برده شده در ستون های جداسازی در الکتروفورز مویین بیشتر از سیلیکای جوش خورده (شیشه خالص) ساخته شده است که یک پوشش بیرونی از پلی ایمید (polyimide) برای استحکام و خم پذیری روی آن پوشانده شده است.اگرچه مویینه ها از دیگر مواد مانند پلی اتیلن یا تفلون نیز ساخته شده اند اما اینها کاربردهای گسترده ای ندارند.پوشش پلی ایمید در بخش کوچکی از مویینه معمولا نزدیک به انتها برداشته میشود و یک پنجره ای برای آشکارسازی نوری برخط الکتروفورز ایجاد میگردد.قطر بیرونی لوله مویینه از 180 تا 375 میکرومتر متغیر است و قطر درونی آن از 20 تا 180 میکرومتر و درازای آن از 20 تا چندین متر تغییر میکند.مویینه های غیر استوانه ای که مناسب برای الکتروفورز مویین هستند اکنون در بازار در دسترس میباشند.برای نمونه لوله های مویین مستطیل شکل یک سطح هموار را که بسیار مناسب تر از لوله های مویین منحنی (استوانه ای ) شکل است برای آشکارسازی است فراهم می آورند.

 

تزریق نمونه (sample injection)

در الکتروفورز مویین حجم هایی از 1 تا 50 نانولیتر به وسیله 1) تزریق هیدرودینامیک  2) تزریق الکتروکینتیک بارگذاری میشود. در تزریق هیدرودینامیک بخشی از یک نمونه با بکار بردن فشار مثبت در ویال ورودی (inlet vial) یا خلا در ویال خروچی(outlet vial) تزریق میشود.حجم نمونه بارگذاری شده وابسته به شرایطی مانند 1) قطر درونی لوله مویین  2) ویسکوزیتی بافر  3) فشار بکار رفته  4)دما  5) زمان است اما به این عامل ها هم محدود نیست . در شماری از سیستم های قبلی از گرانش (gravity) به عنوان منبع فشار با بلند کردن ویال ورودی یا پایین اوردن ویال خروجی و سیفون (siphoning) کردن نمونه برای یک فاصله زمانی معین استفاده میشد.در تزریق الکتروکینتیک یک بخشی از نمونه با بکار بردن ولتاژ در یک فاصله زمانی معین تزریق میشود.بزرگی این ولتاژ بستگی به انالیت و سیستم بافری دارد بطور معمول قدرت میدانی از سه تا پنج برابر کمتر از آنچه که برای جداسازی بکار میرود بکار برده میشود.شایان ذکر است که اگر چه روشهای هیدرودینامیک یک نمونه ای را تزریق میکنند که نمایانگری از کل نمونه (bulk specimen) است اما تزریق به روش الکتروکینتیک هم حرکت انالیتهای بهتر حرکت کننده از نظر الکتروکینتیکی را آسان تر میکند.

در عمل برای کارامدی یک جداسازی بالا درازای بخش بارگذاری نمونه بطور معمول باید کمتر از 2%  درازای لوله مویین باشد.

 

 

آشکار سازی مستقیم (direct detection)

در الکتروفورز مویین انالیتهای جداشده هنگامی که از یک نقطه ای در لوله مویین میگذرند که به شدت به وسیله روشهای نوری بررسی میشود، آشکارسازی و اندازه گیری میشوند. آشکارسازی نوری بر پایه روشهای معمول است مانند 1) جذب فتومتری  2) شاخص شکست (refractive index)  3) فلورسانس . همانند HPLC  فتومترهای فرابنفش-مرئی بطور گسترده ای به عنوان آشکارساز در پایش جداسازی های الکتروفورز مویین بکار گرفته میشوند.برای مرتبط کردن چنین آشکارسازهای برخطی یک پنجره آشکارسازی (detection window) در انتهای خروجی لوله مویین ایجاد میشود. این پنجره  که به عنوان یک کووت در خط (inlet cuvet) عمل میکند با سوزاندن کامل پلی ایمید با یک شعله کوچک و پاک کردن پنجره با اتانول ایجاد میگردد. با این قطر درونی لوله مویین که طول مسیر نوری (optical path length)کووت درخط  را تعیین میکند جداسازی با کارایی بالا آسان میشود. از آنجایی که جذب در تناسب با طول کووت بکار رفته در سیستم نوری است ، قطر درونی 20 تا 100 میکرومتری لوله مویین، آشکارسازی جذب فرابنفش-مرئی را تا غلظتهای 10 ^-8  -  10^-6 mol/L  را فراهم میکند.   

 

بهتر کردن حد آشکارسازی (improving limits of detection)

چندین روش برای بهتر کردن حد آشکارسازی آشکارسازهای برخط الکتروفورز مویین بکار برده شده است. این ها شامل 1) افزایش قطر درونی طول مسیر کووت 2) بکار بردن تکنیکهای نوری حساس تر  3) پیش تغلیظ نمونه .

 

افزایش طول مسیر نوری کووت(increaswd optical path length) . لوله های مویین اصلاح شده با یک سلول حبابی شکل در بخش پنجره آشکارسازی میتوانند توانایی آشکارسازی را بالا و حد شناسایی را تا اندازه ای پایین بیاورند. یک روش دیگر بکار گیری هندسه Z  است که طول مسیر نوری کووت (آشکارسازی از طریق عمق بازوی Z ) را تا اندازه 1 mm افزایش میدهد.

 

آشکارسازهای نوری حساس . تکنیکهای نوری حساسی که همراه با الکتروفورز مویین بکار برده میشوند شامل 1) فلورسانس  2) شاخص شکست (refractive index)  3) کمی لومینسانس  4) اسپکتروفتومتری رامان (raman spectrophotometry)  5) دایکروایسم چرخشی (circular dichroism). حساس ترین روش آشکارسازی نوری فلورسانس القاشده با لیزر (laser-induced fluorescence=LIF) است که توانایی آشکارسازی از  10^-18  -  10^-21 mol/L  و حتی کمتر را دارد.این روش آشکار سازی به آسانی با آنالیتهایی که با سوبستراهای فلورسنت ،نشاندار میشوند (مانند درج شونده (intercalator) ها برای DNA دو رشته ای )یا فلورسنتهای طبیعی (مانند پروتیین ها یا پپتیدهایی که دارای تریپتوفان هستند) قابل دست یابی است. سیستم های الکتروفورز مویین همچنین با اسپکترومتری جرمی مرتبط شده اند و روشهای آشکارسازی الکتروشیمیایی نیز طراحی شده اند اگرچه چنین آشکارسازهایی باید از نظر الکتریکی از ولتاژهای الکتروفورزی جدا باشند.

 

 

غلیظ سازی برخط نمونه (online sample concentration)

تکنیک دیگری که در سیستم الکتروفورز مویین برای افزایش حد آشکارسازی بکار میرود پیش تغلیظ (preconcentration) نمونه است.یکی از آسان ترین روش ها برای پیش تغلیظ نمونه القای اثر پشته سازی (stacking) در اجزای نمونه است که از بکار گیری اختلاف قدرت یونی میان ماتریکس نمونه و بافر جداسازی حاصل میشود.این اثر از این حقیقت حاصل میشود که یونهای نمونه حرکت الکتروفورزی کاهش یافته ای در یک محیط با هدایت الکتریکی بالاتر دارند. هنگامی که ولتاژ در سیستم بکار برده میشود یونهای نمونه در پلاگ نمونه (sample plug) بی درنگ به سمت نزدیک ناحیه بافر جداسازی شتاب میگیرند.به محض گذر از این مرز، محیط با هدایت الکتریکی بالاتر کاهشی در سرعت الکتروفورزی ایجاد میکند و به دنبال آن پشته سازی (stacking) اجزای نمونه در یک ناحیه کوچکتری از بافر نسبت به جایگاه آن در نمونه اصلی رخ میدهد.

 در یک زمان کوتاه شیب قدرت یونی پراکنده میشود و مولکولهای انالیت باردار ،از ناحیه نمونه پشته سازی شده (stacked sample zone) به سمت کاتد شروع به حرکت میکنند.پشته سازی (stacking) در تزریق به روشهای هیدروستاتیک یا الکتروکینتیک هر دو بکار گرفته میشود و بطور معمول یک افزایش ده برابری در غلیظ سازی نمونه ایجاد کرده و حد آشکارسازی را پایین تر می آورد.

یک روش دیگر در پشته سازی تمرکز (focusing) است، تکنیکی است بر پایه تفاوت pH میان پلاگ نمونه (sample plug)و بافر جداسازی (separation buffer) نشان داده شده که این تکنیک در آنالیز پپتیدها بسیار کارا بوده به این خاطر که پپتیدها پایداری نسبی بالایی در بازه گسترده ای از pH را دارا هستند.با افزایش pH نمونه به بالای مقدار pI آنالیتهای مورد جستجو و مرتبط کردن پلاگ نمونه (sample plug) با ناحیه های بافر جداسازی دارای pH پایین (یک حجم هم ارز از با بافر جداسازی دارای pH پایین به دنبال مرتبط کردن پلاگ نمونه ) ،پپتیدهای دارای بار منفی به سمت آند حرکت الکتروفورزی خود را انجام میدهند.به محض ورود بافر جداسازی با pH پایین تر، یک تغییر القا شده با pH حالت بار را در آنها تغییر داده و سبب و سبب واژگونی در حرکت الکتروفورزی و  منجر به تمرکز (focusing) پپتیدها در محل ارتباط نمونه ( pH بالا) و بافر با pH پایین ( همانند ایزوالکتریک فوکوسینگ) میشود.پس از اینکه شیب pH پراکنده میشود پپتیدها دوباره بار مثبت می گیرند و به سمت کاتد بصورت یک ناحیه شفاف (sharp) مهاجرت میکنند.این روش در مورد شماری از انالیتها بکار برده شده است اما محدود به آنهایی است که توانایی ایستادگی در برابر تغییر های pH را بدون دناتوراسیون داشته باشند ، این روش به اندازه پنج برابر توانایی افزایش حد آشکار سازی را داراست .

 

 

آشکارسازی غیر مستقیم (indirect detection)

هنگامی که کروموفورهای قوی در انالیت های مورد جستجو وجود ندارد ، آشکارسازی جذب یا فلورسانس در روش غیرمستقیم بکار برده میشود. در تکنیک جذب ، یک یون با قدرت جذب نوری بالا به الکترولیت حرکت کننده اضافه میشود و در یک طول موجی که جذب پس زمینه بالا و ثابتی را میدهد ، پایش میشود.همینکه یون های حل شده به سمت ناحیه های مشخص خود طی فرایند الکتروفورز حرکت میکنند، این یونها عامل آشکارسازی شونده به روش غیر مسقیم را از طریق دافعه متقابل ، جابجا میکنند و این سبب یک کاهش در جذب پس زمینه به هنگام گذر ناحیه ها (zones) از آشکارساز میشود.ریاجنتهایی با ویژگی های فلورسانس مناسب به روشهایی مشابه بکار برده شده اند. آشکارسازی امینواسیدها به وسیله الکتروفورز مویین در تشخیص امینواسیدوری بکار رفته است.

 

 

 

نظرداشت های تکنیکی (technical considerations)

دما (temperature) و اثر سطح (surface effects) بر توانایی جداسازی الکتروفورز مویین اثر میگذارد. ارتی فکت ها نیز معلوم شده که در الکتروفورز مویین به وجود میایند.

 

اثر دما (temperature effects)

در بسیاری از چارچوبهای لوله ای یا slab برای الکتروفورز، میدان های الکتریکی متوسط ( تا 1000 ولت ) بکار میرود چون گرمای ژول که همراه با میدان الکتریکی با قدرتهای بالاتر است سبب 1) شیب دمایی غیریکنواخت  2) تغییر های محلی در ویسکوزیتی  و 3) گسترده شدن ناحیه (zone) های جداسازی میشود. الکتروفورز مویین از دیگر الکتروفورزها به وسیله میدان های الکتریکی بسیار بالای غیر معمول (30000 ولت) که سبب جداسازی سریع و با کارایی بالا میشود ،بازشناخته میشود.مشکلاتی که در چارچوبهای غیر مویین با آنها روبرو هستیم با پراکنده شدن موثر گرمای ژول با روشهای جریان همرفتی هوای فشرده (forced air convection) یا خنک سازی با مایع (liquid cooling) لوله مویین ،با هر دو قابل پیشگیری است و این بخاطر باریک بودن لوله مویین است.گرمای ژول ایجاد شده تابعی از 1) نوع بافر  2) غلظت  3) ولتاژ بکار رفته  4) قطر درونی لوله مویین  5) درازای لوله مویین است، که برای هر سیستم فرضی با ایجاد نمودار قانون اهم (ohm’s law plot)، ماکزیمم ولتاژ موثر به وسیله آن تعیین میشود.کاهش قطر درونی لوله مویین ، قدرت یونی بافر رونده (running buffer) و یا ولتاژ بکار رفته سبب کاهش گرمای ایجاد شده به وسیله فرایند الکتروفورز میشود. شایان ذکر است که کاهش قطر درونی لوله مویین با حد آشکارسازی (detection limit) اندازه گیری های فرابنفش سازگار خواهد بود اما کاهش میدان الکتریکی بکار رفته مطلوب نیست به این خاطر که توان جداسازی (resolution) نسبت مستقیم با میدان الکتریکی بکار رفته دارد.در پایان اینکه تلاش ها باید به سمت تغییر دیگر عامل ها باشد پیش از اینکه به سمت کاهش قدرت میدان الکتریکی و یا قطر درونی رفت .

 

 

اثر سطح (surface effects)

همانند الکتروفورز به طور کلی ، جریان مایع (جریان الکترواسموتیک یا جریان الکترواندوسموتیک ) در الکتروفورز مویین نتیجه اثر بار سطح موجود در محیط پایه جامد است.در الکتروفورز مویین ، جریان الکترواندوسموتیک یک عامل قابل توجه در فرایند جداسازی است.بار سطح درونی یک لوله مویین از جنس سیلیکا جوش خورده به وسیله حالت یونیزاسیون گروه های سیلانول (SiOH) که سبب محبوبیت آنها شده ، تعیین میشود.بر هم کنش گونه های بافری دارای بار مثبت با آنیون های متصل به سطح یک لایه ای از کاتیون های متحرک ایجاد میکند که هنگام برقراری ولتاژ به سوی کاتد حرکت میکند.این سبب ایجاد یک جریان الکترواندوسموتیک خیلی قوی میشود که تمام انالیتها را در همان جهت جدای از بار آنها به حرکت در میاورد.در پایان، جداسازی بخاطر تفاوت در سرعت مهاجرت الکتروفورزی انالیت ها که بر این جریان الکترواندوسموتیک سوار میشوند ، حاصل میشود.

از آنجایی که نیروی رانش جریان در طول دیوار لوله مویین پخش میشود، پروفایل جریان (flow profile) تقریبا مسطح (flat) است برعکس جریان لایه ای (laminar) یا سهمی (parabolic) که به وسیله سیستم های تحت فشار و نیروهای اصطکاکی در دیواره ایجاد میشود. یک پروفایل جریان مسطح به این خاطر که سبب پراکندگی در ناحیه های مواد حل شده نمیشود ، سودمند است. بزرگی و جهت جریان الکترواندوسموتیک به وسیله چند عامل تحت تاثیر قرار میگیرد شامل 1) نوع الکترولیت بکار رفته 2) pH  3) قدرت یونی  4) بکارگیری افزودنی ها ( مانند سورفکتانت ها و حلال های آلی )  5) میزان قطبی بودن و بزرگی میدان الکتریکی بکار رفته .

اگر چه نسبت سطح به حجم بسیار بزرگ سطح درونی لوله مویین سبب پراکندگی گرمای ژول میشود اما سبب افزایش احتمال جذب آنالیت ها بر سطح دیواره درونی لوله مویین نیز میشود. این سبب پدیده ای به نام دنباله دار شدن قله (peak tailing) ، ویا حتی جذب کامل و برگشت ناپذیر آنالیت میگردد.جذب بطور عمده میان حل شونده های کاتیونی و دیواره درونی لوله مویین که دارای بار منفی است از طریق برهم کنش های یونی (به وسیله گروه های سیلانول دپروتونه =deprotonated silanols) و کمتر از طریق برهم کنشهای هیدروفوبیک (به وسیله گروه های سیلوکسان =siloxanes) انجام میشود.بخاطر وجود بارهای بیشمار و ناحیه های هیدروفوب، اثر جذب در پروتیین ها و به ویژه پروتیین های بسیار کاتیونی قابل توجه است. در عمل جذب مواد به سطح درونی لوله مویین چه از نمونه باشد چه از بافر، زمان مهاجرت و دیگر ویژگی های جداسازی را تغییر میدهد که اگر بدون توجه رها شود، لوله مویین در نهایت ناکارامد میشود. اجزای بافر و یا افزودنی ها مانند سورفکتانت (surfactant) ها میتوانند اغلب تغییرهای همیشگی در سطح درونی لوله مویین از طریق جذب به آن ،ایجاد کنند و همین سبب میشود که لوله های مویین خاص با سورفکتانت هایی خاص بکار برده شوند.

برای کاهش اثر دیواره درونی، لوله های مویین را با مواد شیمیایی و بیشتر با باز (base) ها تیمار میکنند تا مواد جذب شده (adsorbates) را حذف و سطح را دوباره جوان (rejuvenate) کنند.یک روش شستشوی معمولی شستن اتاقک (فضای درون لوله مویین) با 10 تا 20 برابر حجم لوله مویین با NaOH  ، 0.1- 1.0 mol/L  ، و به دنبال آن شستشو با بافر رونده (run buffer)است.برای پیشگیری از قرار گرفتن سطح لوله مویین به تغییرهای بزرگ pH ، روشهای تیمار (conditioning procedures) برای جداسازی در pH های پایین با بکاربردن اسیدهای قوی (مانند HNO3) ، سورفکتانت ها (مانند SDS) یا حلال های آلی مانند استونیتریل(acetonitrile) یا متانول (methanol) انجام میشود.

 

 

 

انواع الکتروفورز مویین (mode of operation)

الکتروفورز مویین را به شیوه های گوناگون میتوان انجام داد شامل 1) زون الکتروفورز مویین (capillary zone electrophoresis=CZE)  2) MEKC  3) ژل الکتروفورز مویین (capillary gel electrophoresis=CGE)  4) ایزوالکتریک فوکوسینگ الکتروفورز مویین (capillary IEF)  5) ایزوتاکوفورز مویین  (capillary ITP) .

 

 زون الکتروفورز مویین

 زون الکتروفورز مویین  (open-tube or free-solution capillary electrophoresis) ساده ترین شکل الکتروفورز مویین است. یون الکتروفورز مویین (capillary ion electrophoresis) جزئ زون الکتروفورز مویین به شمار میرود و به انالیز یونهای غیر آلی به روش زون الکتروفورز مویین میپردازد که اغلب آشکارسازی در آن به روش غیر مستقیم انجام میشود.قدرت زون الکتروفورز مویین در توانایی جداکردن الکتروفورزی گونه های باردار بدون وجود یک ماتریکس غربالگر (sieving matrix) است.این نوع الکتروفورز درباره طیف گسترده ای از انالیت ها شامل پروتیین ها،پپتیدها ،و امینواسیدها و مولکولهای کوچک (مانند داروها ) و یونها کاربرد دارد.

 

انالیز پروتیین های سرم (serum protein analysis)

در مقایسه با اگاروز ژل الکتروفورز و سلولوز استات الکتروفورز ، زون الکتروفورز مویین برای انالیز پروتیین های سرم برتری های بسیاری دارد.شکل 12-7 مقایسه جداسازی پروتیین ها را به وسیله 1) سلولوز استات الکتروفورز  2) اگاروز ژل الکتروفورز  3) الکتروفورز مویین نشان میدهد.

وجود زون های معمول در الکتروفورز مویین بطور کامل مشخص است و علاوه بر آن شناسایی ابنورمالی های پروتیین سرم در ناحیه گاما امکان پذیر است. بررسی های گذشته نگر (retrospective studies) نشان داده که الکتروفورز مویین در تشخیص پروتیین های منوکلونال و تعیین نوع آنها با تکنیکهای معمول دیگر بسیار موثر است.از این بررسی ها این نتیجه گیری میشود که الکتروفورز مویین از اگاروز ژل الکتروفورز بسیار حساس تر است.مطالعه های دیگر نشان داده که زون الکتروفورز مویین در انالیز پروتیین های سرم بسیار ارزشمند بوده است.

 

 

 

آرتی فکت در انالیز پروتیین سرم (artifacts in serum protein analysis)

در کار با الکتروفورز مویین با آشکارساز نوری برخط، آرتی فکتها به شکل پیک (قله) های سیستم(system peaks)،نمایان میشوند.این آرتیفکت ها بیشتر ، از نمونه یا از ارتباط نمونه با بافر جداسازی ریشه میگیرند و چون این گونه (species) ها در طول موج آشکارسازی جذب دارند بنابراین یک پاسخ ایجاد میکنند.تفاوت این با الکتروفورز پروتیین در slab gel در این است که در الکتروفورز slab gel اختصاصیت آشکارسازی (detection specificity) به وسیله رنگ اختصاصی به پروتیین تعیین میشود.برای نمونه ، این پدیده درباره گونه های بافری که در نمونه وجود دارند اما در بافر جداسازی وجود ندارند نامعمول نیست که بتوانند پیک سیستم (system peaks)تولید کنند.با این حال الکتروفورز پروتیین سرم بالینی نمونه ای است که به وسیله آن آرتیفکت ها در الکتروفورز مویین حذف میشوند.

یک مشکل که همراه با الکتروفورز معمول پروتیین های سرم است میل ارتیفکت ها در نقطه بارگذاری (point of application) است.این باندها (bands) از این واقعیت ریشه میگیرند که حرکت الکتروفورتیک ( برای نمونه در اگاروز ژل الکتروفورز) از نقطه بارگذاری، دو جهتی (bidirectional) است.درنتیجه نقطه بارگذاری بخشی از ناحیه اسکن شونده خواهد بود.این باندها باید ایمونوتایپ شوند تا پروتیین های منوکلونال واقعی از ارتیفکت ها تشخیص داده شوند که فرایندی پرهزینه و زمان بر است.الکتروفورز مویین به دو روش از ارتیفکتهای نقطه بارگذاری پیش گیری میکند.اول اینکه حرکت خالص در الکتروفورز مویین از جمع جبری حرکت الکتروفورتیک پروتیین و جریان الکترو اندوسموتیک ریشه میگیرد.در نتیجه این حرکت یک جهتی (unidirectional) (به سمت آشکارساز) نقطه بارگذاری به وسیله آشکارساز اسکن نمیشود.دوم اینکه برخلاف اگاروز ژل الکتروفورز که پرسیپیتات(precipitates) ها نمی توانند از چاهک بارگذاری خارج شوند و وارد ژل شوند (و بنابراین به شکل یک باند در ناحیه اسکن شده ژل دیده میشوند)، در زون الکتروفورز مویین ماتریکسی از ژل وجود ندارد تا مانع مهاجرت الکتروفورتیک شود و انالیز در یک محلول آزاد رخ میدهد.این پدیده به وسیله Clark و همکاران بررسی شد، آنها یک زیر مجموعه کوچکی از نمونه های سرمی دارای پروتیین های منوکلونال را ارزیابی کردند و دیدند که این پروتیین ها در ژل اگاروز (و سلولوز استات )در نقطه بارگذاری باقی ماندند اما در الکتروفورز مویین به آسانی حرکت کردند.این پرسیپیتات ها ممکن است یوگلوبولین (euglobulin) یا کرایوپرسیپیتات (cryoprecipitate) باشند و ممکن است دارای پروتیین منوکلونال باشند یا نباشند و تنها ایمونوالکتروفورز یا ایمونوفیکساسیون میتواند وجود پروتیین های منوکلونال را شناسایی کند.

 

 

میسلار الکتروکینتیک کروماتوگرافی (micellar electrokinetic chromatography=MEKC)

MEKC ترکیبی از الکتروفورز و کروماتوگرافی است. MEKC از کروماتوگرافی الکتروکینتیک مویین (capillary electrokinetic chromatography=CEC) متفاوت است، این یک تکنیک الکتروفورتیک بسیار موثر است که مواد حل شده باردار (charged) و خنثی (neutral) را همزمان جدا میکند.جداسازی گونه های خنثی (neutral species) با بهره گیری از میسل های شکل یافته به هنگام گذر غلظت سورفکتانت از غلظت بحرانی میسل (critical micelle concentration) ( برای نمونه 8 – 9 mmol/L برای SDS) در بافر رونده (running buffer) انجام میشود. طی الکتروفورز ، میسل های خنثی می توانند با انالیت ها از طریق نیروهای هیدروفوبیک به شیوه کروماتوگرافی برهم کنش کنند، آنالیتها برپایه میزان هیدروفوب (آبگریز ) بودنشان میسلیزه (Micellized) میشوند.تحت این شرایط بخش بندی (partitioning) به درون میسل ،نیروی رانش برای جداسازی را فراهم میکند.با میسل های دارای بار (مانند SDS) آنالیتها میتوانند به وسیله نیروهای الکتروستاتیک از طریق بارهای سطح میسل برهمکنش کنند.

 

ژل الکتروفورز مویین (capillary gel electrophoresis)

ژل الکتروفورز مویین با الکتروفورز سنتی در لوله (tube) یا ورقه (slab) قابل مقایسه است چون مکانیسم جداسازی یکسان است.جداسازی برپایه اندازه (size separation) به وسیله پلیمرهای مناسب که به عنوان یک غربال مولکولی عمل میکنند ، انجام میشود.همینکه آنالیتهای باردار از طریق شبکه پلیمری مهاجرت میکنند ، شبکه پلیمری بر پایه اندازه آنالیتها مانع از پیشرفت مهاجرت میشود( مولکولهای بزرگتر بیشتر از مولکولهای کوچکتر ممانعت میشوند).ماکرومولکولها، مانند DNA و پروتیین های سیرشده با SDS نمیتوانند بدون یک ژل یا دیگر مکانیسم های جداسازی جدا شوند چون در آنها نسبت جرم به بار به اندازه ای است که آنها را مستقل از اندازه (size independent) میکند.واژه ژل در ژل الکتروفورز مویین یک نامگذاری گمراه کننده است بیشتر به این خاطر که ژل با اتصالهای متقاطع آنطور که ما آنها را در قالبهای Slab میشناسیم به طور معمول در الکتروفورز مویین بکار نمیروند.واژه مناسبتر ماتریکس غربالگر (sieving matrix) یا شبکه پلیمر محلول (souble polymer network) است که یک ساختار پلیمری خطی است که محلول بوده ، ویسکوزیتی بطور منطقی پایینی داشته و توانایی به هم تابیده شدن به شیوه ای را دارند که روزنه هایی را شکل داده و از طریق آنها غربالگری رخ میدهد.شماری ماتریکس پلیمری برای آنالیز DNA ( مانند پلی اکریلامید ، مواد سلولوزی ) و پروتیین ( مانند ماتریکسهای بر پایه دکستران ) تعریف شده اند که روزنه های آنها میتوانند قطرهایی در گستره ده ها تا صدها نانومتر را داشته باشند.یکی از نیازها که اغلب همراه این نوع از آنالیز است کاهش جریان الکترو-اسموتیک است.

این منظور به وسیله پوشاندن سطح (درون لوله مویین) به طور کووالانسی (covalently) یا جذب (adsorptively) و یا دینامیکی (dynamically) تامین میشود.پلی اکریلامیدهای با اتصالهای متقاطع اصلی ترین پلیمر انتخابی برای این منظور بودند اما به تازگی با ماتریکس های پلیمری جایگزین شده اند که نه تنها یک غربال مولکولی موثری را فراهم میکنند بلکه سطح درونی لوله مویین را با مکانیسم جذبی می پوشانند.

 

 

ایزوالکتریک فوکوسینگ الکتروفورز مویین (capillary isoelectric focusing electrophoresis)

ایزوالکتریک فوکسینگ الکتروفورز مویین با نوع لوله ای آن قابل مقایسه است و از همان اصول و روشها پیروی میکند.تقاوتی که با ایزوالکتریک فوکوسینگ الکتروفورز معمولی دارد در این است که میتوان آن را با یک محلولی آزاد از امفولیت ها و یا با یک ژل از پیش آغشته شده انجام داد.همانطور که از الکتروفورز مویین انتظار میرود و بر خلاف ایزوالکتریک فوکوسینگ الکتروفورز معمولی ، زون های متمرکز شده ،از پشت آشکارساز برخط (online detector) در طی فرایند تمرکز (focusing process) یا به دنبال آن گذر میکنند.شکل 12-8 یک نمونه از این را نشان میدهد که جداسازی به وسیله ایزوالکتریک فوکوسینگ الکتروفورز مویین در مدت زمان 15 دقیقه انجام شده است و فرایند ایزوالکتریک فوکوسینگ الکتروفورز معمولی و نیاز به روشهای الکتروفورزی دیگر را (مانند سلولوز استات الکتروفورز) را که هر دو بسیار از نظر زمان کارایی کمی دارند را به آسانی دور میزند.

 

ایزوتاکوفورز مویین (capillary isotachophoresis)

ایزوتاکوفورز مویین در اساس همان ویژگی های را دارد که ایزوتاکوفورز معمولی در دیگر قالب ها دارد بجز اینکه شرایط یک ایزوتاکوفورز ناب قابل دست یابی نیست و به عنوان یک الکتروفورز مویین واقعی استفاده نمیشود. بجای آن در پیش تغلیظ بر خط نمونه (online sample preconcentration) بکار میرود( همانطور که پیشتر توضیح داده شد). همچنین به عنوان یک مرحله پیش تغلیظ در حالتهای ترکیبی با زون الکتروفورز مویین ، MEKC ، یا ژل الکتروفورز مویین از آن استفاده میشود.با این حال ایزوتاکوفورز در حال طی کردن دوره رنسانس خود است.Everarts اول بار آشکار کرد که از ایزوتاکوفورز میتوان به یک تکنیک فراهم کردن نمونه (sample preparation technique) در کروماتوگرافی مایع از آن استفاده کرد.

 

 

منبع:تیتز پایه های شیمی بالینی و تشخیصهای مولکولی،ویرایش پنجم،فصل دوازدهم

,Tietz; textbook of clinical chemistry and  molecular diagnostics ,fifth edition,chapter12