نفلومتری(nephelometry) و توربیدیمتری(turbidimetry)
نفلومتری(nephelometry) و توربیدیمتری(turbidimetry)
پراکنش نور یک پدیده فیزیکی است که از برهم کنش نور با ذرات درون محلول ایجاد میشود.نفلومتری و توربیدیمتری روشهای آنالایتیکالی هستند که برای اندازه گیری نور پراکنده شده بکار برده میشوند.اندازه گیری پراکنش نور در ایمونواسی شماری از پروتیین ها و هاپتن هایی ویژه بکار رفته است.
مفهوم های پایه
پراکنش نور هنگامی رخ میدهد که انرژی تابشی گذرنده از یک محلول با یک مولکول در یک برخورد الاستیک روبرو میشود که سبب پراکنش نور به هر سویی میشود.برخلاف گسیل فلورسانس نور پراکنده شده دارای همان فرکانسی است که نور برخوردی دارد.
عامل هایی که بر پراکنش نور اثر دارند عبارتند از اندازه ذره ، وابستگی طول موج ، فاصله تا آشکار ساز ، اثر پلاریزاسیون نور برخوردی ، غلظت ذره ها ، و وزن مولکلولی ذره ها.
اندازه ذره (particle size)
معادله پراکنش Rayleigh که در بخش بعد آمده است در مورد پراکنش نور از ذره های کوچک با اندازه ای بسیار کوچکتر از طول موج نور برخوردی ( به عنوان نمونه ، اندازه ذره < λ/10 ) کاربرد دارد.هنگامی که اندازه ذرات بسیار کوچکتر از طول موج نور برخوردی باشد، هر ذره در زمان یکسان ، در یک میدان الکتریکی یکسان قرار میگیرد. امواج نوری بازتابی یا پراکنده شده از یک ذره کوچک هم فاز بوده و هم دیگر را تقویت میکند. همانطور که ذرات بزرگتر طول موج نور برخوردی میشوند. امواج نوری بازتابی دیگر هم فاز نیستند. در بخشی از جهت ها تقویت بازتابش رخ میدهد و تداخلهای نابودکننده در جهت های دیگر.الگوی پراکنش از این ذره های بزرگ با اندازه و شکل ذره ارتباط دارد.
وابستگی پراکنش نور به طول موج
درسال 1871 Lord Rayleigh معادله ای را که در ادامه امده است را بیان کرد که بستگی شدت نور پراکنده شده را به شدت نور برخوری نشان میدهد.
که
Is= شدت نور پراکنده شده
I0= شدت نور تحریک کننده
a= توانایی پلاریزه کنندگی ذره کوچک
Θ= زاویه دید
λ= طول موج نور برخوردی
r= فاصله بین پراکنش نور تا آشکار ساز
همانطور که معلوم است شدت پراکنش نور با طول موج نور برخوردی رابطه عکس دارد.نیز از این معادله معلوم میشود که شدت نور پراکنده شده با فاصله r ذرات پراکنده کننده نور تا آشکار ساز رابطه عکس دارد.بنابراین آشکار ساز باید بسیار نزدیک به سلول نمونه باشد.
عامل غلظت و وزن مولکولی در پراکنش نور
ارتباط مستقیم پراکنش نور با غلظت و وزن مولکولی ذره ها را میتوان از معادله پیشین به شکل معادله زیر گرفت.
که در آن
Is= شدت نور پراکنده شده از ذره های کوچک که با نور پلاریزه شده تحریک شده اند.
I0= شدت نور برخوردی
dn / dc = اندازه تغییر اندکس شکست حلال در برابر تغییر غلظت ماده حل شونده.
M= وزن مولکولی (g/mol)
C= غلظت ذرات (g/mL)
Θ= زاویه دید
Na= عدد اووگادرو
λ = طول موج نور برخوردی
r = فاصله میان پراکنش نور تا آشکارساز
مهمترین چیزی که در این معادله آشکار است ارتباط مستقیم پراکنش نور با غلظت و وزن مولکولی ذرات است.
اثر نور پلاریزه بر پراکنش نور
دو معادله پیشین شکل های مختلف از معادله Rayleigh برای پراکنش نور به وسیله ذرات کوچک تحریک شده با نور پلاریزه است.شکل 10 – 17 ، A ، اثر نور پلاریزه و غیر پلاریزه بر شدت پراکنش نور از ذرات کوچک را به صورت تابعی از زاویه پراکنش نشان میدهد. منحنی 2 طرحی از شدت متقارن و کروی که معادله 10 پیش بینی میکند را نشان داده است. منحنی 3 طرحی از شدت به دست آمده از جمع منحنی های 1 و 2 است و شدت پراکنش زاویه ای نور پراکنده شده از ذرات کوچک تحریک شده با نور غیرپلاریزه را نشان میدهد.منحنی های 1 و 2 شدت نور پلاریزه عمودی و افقی را نشان میدهد که نور غیرپلاریزه هم در آن در نظر گرفته میشود.معادله Rayleigh برای پراکنش نور از ذرات کوچک که با نور غیرپلاریزه تحریک شده اند به شکل زیر بیان میشود.
دو نکته مهم که از معادله 12 و شکل 10-17 ،A ، به دست میاید یک اینکه همه نور پراکنده شده از ذرات کوچک هنگامی که با نور پلاریزه تحریک شده باشند از هنگامی که با نور غیر پلاریزه تحریک شده باشند کمتر است ،و سیگنال پس زمینه از پراکنش نور در اندازه گیری های فلورسانس را میتوان با یک پلارایزری که بطور مناسب در برابر آشکار ساز نور گسیل یافته جاگذاری شده است را کاهش داد. دوم اینکه شدت پراکنش نور از ذرات کوچک تحریک شده با نور غیر پلاریزه یک وابستگی تقارن زاویه ای پراکنش نوری در محور 90 را نشان میدهد( شکل 10-17 ، A ، منحنی 3 را ببینید).
وابستگی زاویه ای پراکنش نور
وابستگی زاویه ای پراکنش نور از ذرات کوچک ( کمتر از λ /10) در بخش پیشین در شکل 10-17 ،A ( منحنی 3) نشان داده شد.بررسی شکل 10-17 ،A ، نشان میدهد که مقدار شدت پراکنش نوری به سمت جلو و به سمت عقب (I0 در 0 و 180 درجه ) یکسان است.با اینحال شدت پراکنش نور در 90 درجه بسیار کمتر است . همینطور که ذره بزرگتر میشود ( بیشتر از λ/10) وابستگی زاویه ای پراکنش نور همانطور که در شکل 10-17 ، B نشان داده شده است به سمت یک ارتباط نامتقارن سو گرایی میکند.در این حالت شدتهای پراکنش نور در زاویه های جلو و عقب با هم یکسان نیستند،پراکنش نوری به سمت جلو بسیار بزرگتر است. همچنین شدت پراکنش نوری در 90 درجه بسیار کمتر از شدت در زاویه جلو (0 درجه ) است. همینطور که ذره بزرگتر میشود این بی تقارنی نیز بیشتر میشود.این بی تقارنی و وابستگی زاویه ای پراکنش نور و وابستگی به اندازه ذرات در تعیین ویژگی و تشخیص گروه های مختلف ماکرومولکولها و سلول ها کارایی بسیار دارد.همانطور که پیشتر گفته شد ویژگی پراکنش نور در طراحی فلوسایتومترها بکار میرود.این دستگاه ها پراکنش نور را در زوایه نزدیک به جلو (near forward) و پراکنش نوری در زاویه راست(right angle) را برای ذرات سلولی که از یک سلول نوری میگذرند و به وسیله یک لیزر شدت بالا تحریک میشوند ، اندازه گیری میکند. از نسبت شدت پراکنش نوری رو به جلو به شدت پراکنش نوری به زاویه راست در تشخیص اندازه سلول ها در این دستگاه ها استفاده میشود.
پراکنش نور و پروتیین های پلاسما
معادله پراکنش نور که در معادله (10) آورده شده است درباره محلولهای رقیق ذرات کوچک درست است اگر بزرگترین اندازه این ذرات کمتر از یک دهم طول موج نور برخوردی باشد.بنابراین مرز بالای اندازه ذرات که پراکنش Rayleigh را نشان میدهند در حدود 40 nm است چنانچه نور مرئی با طول موج 400 nm بکار رفته باشد.بسیاری از پروتیین های پلاسما مانند ایمونوگلوبولین ها ، بتا لیپوپروتیین ها و البومین پایین تر از این حد هستند. برای ذرات بزرگتر ( 40 – 400 nm) وابستگی زاویه ای نور پراکنده شده ،تقارن خود حول محور 90 درجه را همانطور که در شکل 10-17 نشان داده شده است از دست میدهد و یک افزایشی در پراکنش رو به جلو خواهد داشت.شماری از پروتیین های پلاسما مانند ایمونوگلوبولین کلاس M ، کیلومیکرون ها و کمپلکس های ایمونوگلوبولین -انتی ژن در این گستره اندازه ای قرار میگیرند.پراکنش نوری ذرات با این گستره اندازه ای زیر عنوان پراکنش Rayleigh – Debye تعریف میشوند و معادله این نوع پراکنش پیچیده تر است.ذراتی مانند گلبولهای سرخ خون و باکتریها بزرگتر هم هستند (7000 – 40000 nm) . این ذرات وابستگی زاویه ای پیچیده ای از پراکنش نوری را نشان میدهند و پراکنش نوری از این ذرات بزرگ با معادله پراکنش Mie تعریف میشود.این ذرات بزرگ یک پراکنش نوری زیاد در یک گستره زاویه ای باریک و رو به جلو تولید میکنند.
اندازه گیری نور پراکنده شده
توربیدیمتری (turbidimetry) و نفلومتری (nephelometry) روشهایی هستند برای اندازه گیری نور پراکنده شده.چنین روشهایی در اندازه گیری پروتیین های سرم پرکاربرد بوده است.(فصل 15 و 22 را ببینید)
توربیدیمتری (turbidimetry)
توربیدیتی سبب کاهش شدت پرتو نور برخوردی به هنگام گذر از محلول ذرات میشود.اندازه گیری این کاهش در شدت ،توربیدیمتری نامیده میشود.مانند اسپکتروسکوپی جذب ، توربیدیتی به صورت زیر تعریف میشود.
که در آن :
t = توربیدیتی
b = طول مسیر نور برخوردی از محلول دارای ذرات پراکننده نور.
I = شدت نور گذر کرده
I0 = شدت نور برخوردی
توربیدیتی در زاویه 180 درجه از نور برخوردی یا به زبان ساده تر به همان روش اندازه گیری جذب در یک طیف سنج انجام میشود.توربیدیتی در بیشتر اسپکتروفتومترها و آنالایزر های خودکار شیمی بالیتی انجام میشود.
نفلومتری (nephelometry)
نفلومتری ، تشخیص انرژی نوری پراکنده شده (scattered light)یا بازتاب یافته (reflected light) به سوی آشکارساز است که همسو با نور گذر کرده (transmitted light) نیست.نفلومترهای معمول نور پراکنده شده را در زاویه راست از نور برخوردی اندازه میگیرند.یک دستگاه نفلومتری برتر،دستگاهی است که هنگام قرار گیری یک محلول تهی از ذرات ، نورهای ناخواسته (stray light) ،نورهای پراکنده شده و سیگنالهای دیگر به وسیله آشکارساز آن دیده نمیشود. با این حال بخاطر بخش های ایجاد کننده نورهای ناخواسته در سیستم نوری این دستگاه ها و نیز کووت نمونه و یا خود نمونه ، یک میدان کاملا تاریک هنگام اندازه گیری های نفلومتری بسیار سخت است.شماری از نفلومترها طوری ساخته شده اند که نور پراکنده شده را زاویه ای غیر از 90 درجه اندازه میگیرند تا از برتری شدت بالای پراکنش به جلو (forward scatter) به وسیله ذرات بزرگ بهره گیری کنند( مانند کمپکس های ایمنی ).
انتخاب روش (selection of methods)
گزینش بین روش توربیدیمتری و نفلومتری بستگی به کاربرد و دستگاه های موجود دارد.با این حال نفلومتری هنگامی که اندازه کمی از واکنش های انتی ژن – انتی بادی داشته باشیم جساسیت بیشتری دارد.
دستگاهی کردن (instrumentation)
توربیدیمترها و نفلومترها برای اندازه گیری شدت پراکنش نور بکار برده میشوند.
توربیدیمتر (turbidimeter)
اندازه گیری توربیدیتی در فتومترها و اسپکتروفتومترها به آسانی انجام میشود و نیاز به مناسب سازی کمی دارد.نگرانی در اندازه گیری های توربیدیمتری نسبت سیگنال به نویز (signal to noise ratio) است.سیستم های نور سنجی (فوتومتری ) با نویز الکترواپتیکی 0.0002 - + واحد جذب یا کمتر برای اندازه گیری توربیدیتی مناسب هستند.
نفلومتر (nephelometer)
اگر چه پراکنش نور را میتوان با فلورومترها یا فتومترهای استاندارد اندازه گرفت با این حال وابستگی زاویه ای شدت پراکنش نور سبب ساخت نفلومترهای ویژه ای شده است.در نفلومترها یک آشکار ساز از نوع PMT (فتومالتی پلایر تیوب ) در زاویه های مناسب با پرتو نور تحریک کننده جایگذاری میشود.اصول طراحی یک نفلومتر مانند اصول طراحی بکار رفته در اندازه گیری های فلورسنس است.بزرگترین تفاوت عملکردی میان یک فلورومتر و یک نفلومتر این است که در نفلومتر طول موج های تحریک و طول موج های گسیل را روی مقدارهای یکسان قرار میدهند.نگرانی های عمده در دستگاهی کردن اندازه گیری پراکنش نور ، شدت نور تحریک ، طول موج ، فاصله آشکارساز از کووت نمونه ، و کم کردن نورهای ناخواسته است.
همانطور که در شکل 10-18 نشان داده شده است بخشهای پایه ای یک نفلومتر شامل 1) یک چشمه نور 2) بخش های نوری تنظیم کننده 3) یک سلول نمونه 4) بخشهای نوری جمع کننده که شامل بخش های اپتیکی پراکنش نور ، یک فیلتر اپتیکی آشکار ساز و یک آشکار ساز است.
در عمل بخشهای اپتیکی بکار رفته در توربیدیمترها و نفلومترها همانند بخشهای بکار رفته در فلورومترها و فتومترها است.برای نمونه چشمه های نوری بکار رفته معمول لامپ های کوارتز-هالوژن ، لامپهای زنون و لیزرها هستند.لیزرهای هلیوم – نئون که در 633 nm کار میکنند،در کاربردهای پراکنش نور مانند ایمونواسی برپایه نفلومتری و تعیین شکل و اندازه ذرات بکار گرفته میشوند.
به علاوه ratio-referencing فلورومترها برای اندازه گیری های نفلومتری بسیار مناسب هستند.
محدودیت های اندازه گیری پراکنش نور
انتی ژن مازاد (antigen excess) و اثر ماتریکس (matrix effects) محدودیت هایی هستند که توربیدیمترها و نفلومترها هنگام اندازه گیری آنالیت ها روبرو میشوند.
آنتی ژن مازاد (antigen excess)
واکنش های انتی ژن – انتی بادی پیچیده بوده و در یک مخلوطی از اندازه های مختلف رخ میدهند.همینطور که توربیدیتی هنگام اضافه کردن انتی ژن به انتی بادی ها افزایش می یابد ، سیگنال نیز به مقدار ماکزیمم میرسد و پس از آن کاهش می یابد.نقطه ای که در آن کاهش شروع میشود همان آغاز فاز انتی ژن مازاد است.بنابراین روشهای پراکنش نور در اندازه گیری واکنشهای انتی ژن – انتی بادی باید یک روشی را در تشخیص انتی ژن مازاد فراهم کنند.کینتیک تشکیل کمپلکس ایمنی اندازه گیری شده به روشهای نفلومتری و توربیدیمتری به اندازه کافی در هر سه مرحله – انتی بادی مازاد ، مرحله هم ارزی ، و انتی ژن مازاد – متفاوت هستند و الگوریتم های کامپیوتری طراحی شده به طور خودکار انتی ژن مازاد را هشدار میدهد.
اثر ماتریکس (matrix effects)
ذرات ، حلال ، و همه ماکرومولکولهای سرم نور را پراکنده میکنند. لیپوپروتیین ها و چیلومیکرون هادر سرم های لیپمیک بیشترین پس زمینه را در توربیدیمتری یا نفلومتری ایجاد میکنند.با رقتهای درست شدت نسبی نمونه لیپمیک کمتر از بلانک انتی سرم خواهد بود.با این حال همینطور که غلظت انتی ژن در سرم کاهش پیدا میکند و به دنبال آن نمونه های کمتر رقیق شده باید بکار برده شوند ف تداخل پس زمینه در نمونه های لیپمیک بزرگتر میشود. یک روش موثر در کم کردن این تداخل پس زمینه ،بکارگیری روش آنالیز سرعت (rate analysis = rate measurement) که در آن بلانک ابتدایی نمونه حذف میشود.ذرات بزرگ مانند گرد و غبار معلق نیز سبب تداخل پس زمینه ای قابل توجهی میشوند.این تداخل پس زمینه ای با فیلتر کردن همه بافرها و انتی سرم های رقیق شده پیش از آنالیز کنترل میشوند.
منبع:تیتز پایه های شیمی بالینی و تشخیصهای مولکولی،ویرایش پنجم،فصل دهم
,Tietz; textbook of clinical chemistry and molecular diagnostics ,fifth edition,chapter10
