فصل پنجم - نظرداشت های تئوری

فصل 5

نظرداشت های تئوری

این فصل جنبه های استفاده از الایزا در حل مشکلات ، تعاریف واژگان موجود در سرولوژی ،ساختار انتی بادی و تولید انتی بادی در حیوانات ،واحدها ، رقت ها و مولاریته را مورد بررسی قرا رمیدهد.انتی بادی ها - یک دستنوشته ازمایشگاهی شامل تکنیکهای دستنویس مرتبط با الایزا است و و تمام محقیقن درگیر در کار تجربی با انتی بادیها باید این دستنوشته را داشته باشند.این دستنوشته ها در ref2 – 3 ارایه شده و نیز اطلاعات عملی گسترده ای را فراهم میکنند.

 

1

طراحی و استفاده از الایزا

هدف اصلی در طراحی یا استفاده از الایزا این است که بعضی از واکنشگرها را اندازه بگیریم.نیاز به اندازه گیری یک ماده هدف اصلی سنجش است .الایزا در زمینه های علوم محض و علوم کاربردی قابل استفاده هستند اما دلیل اصلی که طراحی آنها را ارزشمند میکند ظرفیت بالای آنها در مدیریت نمونه ، حساسیت انالیتیکی عالی و آسان بودن انجام آنها است.دلیل دیگر آسان بودن خوانش است بنابراین هنگامی که ازمایش اشتباه انجام شده باشد زمان برای خوانش هدر نمیرود.بنابراین الایزا را قبل از ماشین می توان با چشم ارزیابی کرد برای مثال در خوانش 1000 نمونه  قبل از اینکه این داده ها به وسیله ماشین حاصل شود(همانند رادیو ایمونواسی) زمان هدر نمی رود .باید دقت شود که ازمایش های موفق را نباید تنها به این خاطر که الایزا روی مد است کنار گذاشت .ارتباط بین نتایج الایزا و نتایج دیگرسیستم های ازمایش باید طوری باشد که مقدار زیادی داده های مقایسه ای از کار با الایزا و یک یا چند سنجش دیگر برای طراحی الایزا به عنوان سنجش استاندارد فراهم شود.

2

درحال حاضر چه چیزی معلوم است

اغلب مقداری دانش در مورد هر مشکلی که یک محقق با آن مواجه میشود در نوشتارهای علمی وجود دارد .بنابراین جستجو لازم است. این جستجو در اساس شامل جزییا ت کار در رابطه با عامل بیولوژیکی (انتی ژن ) مورد بررسی و هر کاردیگر و ارتباط آن کارها با میزبان های معین در مطالعات تجربی (حیوانات ازمایشگاهی) و زمینه ای میباشد.این دانش را می توان به دو مقوله تقسیم بندی کرد،جنبه های بیوشیمیایی /بیولوژی مولکولی عامل و جنبه های ایمونولوژیکی (سرولوژی و ایمونولوژی) آنها .

نوشتار ممکن است دقیقا به آن عامل ویا عاملی مشابه که محقق می خواهد مطالعه کند پرداخته باشد و نیز مشخص شود که آیا در این رابطه الایزا انجام شده است . واضح است که دو جنبه بیوشیمی و سرولوژی به واسطه میزبان به هم مرتبط هستند.کار اصلی در شروع هر مطالعه ای این است که هدف ها را به درستی تعریف کنیم.همچنین محققین باید مطالعات منتشر شده را با دقت کار کنند چون اغلب سنجش ها بسیار ضعیف طراحی و یا آنکه با داده های بسیار کمی اعتبار بخشی شده اند.محققین همچنین باید به دنبال توصیه هایی از دیگران در زمینه مربوط باشند و بررسی کنند که ایا ریاجنتهای مورد نظرهم اکنون تولید شده و اینکه قابل بکارگیری هستند . یک حوزه ویژه استفاده از انتی بادیهای منوکلونال است.

یک کاتالوگ عالی از ریاجنتهای ایمونولوژیکی موجود است . لینسکات ،ریاجنتها و تامین کنندگان هزاران ریاجنت پلی کلونال و منوکلونال را که ارتباط مستقیم با الایزا دارد فهرست و به روز رسانی میکند. اطلاعات بیشتر همچنین در کاتالوگهای تجاری که اغلب توضیحات تکنیکی استفاده از محصولاتشان را با جزیات گفته اند وجود دارد.

 

 

3

پیچیدگی مشکلات

پیچیدگی مشکلات در تمام ارتباط بین عامل و میزبان تظاهر یافته است.مفهوم ارتباط بین انتی ژنیسیته / ایمونوژنیسیته و محفاظت باید دراین زمینه بررسی شود .بنابراین ویژگی های انتی بادی ها و انتی ژنها باید بررسی شوند .این کتاب تئوری های ایمونولوژی را بررسی نمیکند و کتابهای مرجع برای جزیات بیشتر باید مطالعه شود.این فصل دانش های مرتبط را برجسته میکند تا اطلاعات دیگری مورد توجه قرار گیرد.تعریفهای ذیل کمک کننده است.

 

3.1.

انتی ژنیسیتی

انتی ژنیسیتی توانایی پروتیین ها و کربوهیدراتها در برانگیختن و ساخت انتی بادی ها است که طبق تعریف این انتی بادی ها بطور اختصاصی به همان انتی ژنهایی متصل میشوند که برای تزریق به حیوانات استفاده شده اند.انتی بادی ها ممکن است در نتیجه تکثیر یک عامل یا از طریق تزریق همه یا بخش هایی از آن عامل تولید شوند.این تعریف را میتوان بیشتر اصلاح کرد طوریکه  پپتیدهای معین یا پلی پپتیدها استفاده شوند.انتی ژنهایی که استفاده شده اند تا انتی بادی ها را برانگیزند در عوض خود میتوانند در ازمایشاتی مانند الایزا استفاده شوند.

 

3.2

ایمونوژنیسیتی

ایمونوژنیسیتی اندازه ای است از اثرات اتصال انتی بادیهای ایجاد شده توسط هر ماده ای.بطور اختصاصی یک اثر ،درجه ای از ایمنی است که علیه عامل بیماری ایجاد می شود.بطور کلی چنین اندازه گیری هایی در شرایط ازمایشگاهی یا سیستم های حیوانی غیر از آنهایی که دراین زمینه استفاده شده اند ،انجام میگردد.

 

3.3

محفاظت

تولید انتی بادی  و اثبات پاسخ های ایمنی الزاما به آن معنا نیست که حیوانات در برابر چالش عامل بیماری محفاظت خواهند شد.ارتباط نتایج ایمونواسی در محفاظت هرگز ارتباطی مستقیم نیست بخاطر اینکه بسیاری از فاکتورهای دیگر در پاسخ ایمنی دخیل هستند مانند ایمنی سلولی.

 

4

ملاحظات انتی ژنی

 اساس فهمیدن اینکه چه چیزی در الایزا اندازه گیری میشود تعریف واژگان است شامل انتی ژنها و انتی بادی ها و فهمیدن پیچیدگی های اندازه ،تعداد مکان ها ی ممکن انتی ژنی (اپی توپ ) ، توزیع اپی توپ ها (فاصله بین آنها ) ، تنوع اپی توپ ها ، تاثیر بر تنوع اپی توپها در سیستم های سنجشی متفاوت و غیره .همانطور که اندازه ( وزن مولکولی ) عوامل بیماری افزایش می یابد پیچیدگی نیزافزایش می یابد.

4.1

ملاحظات اندازه

ایمونواسی باید با بیشترین دانش ممکن از تمام مطالعات قبلی طراحی شود.پیچیدگی عامل ها بطور کلی با اندازه آنها افزایش می یابد.بر پایه زمینه های تئوری ارتباط اندازه با پیچیدگی احتمالی را میتوان با بررسی عوامل کروی با قطرهای مختلف که از 25 nm شروع کرد (به عنوان مثال اندازه یک ذره ویروسی بیماری پا و دهان ).

می توان محاسبه کرد که ناحیه ای که توسط مولکول Fab احاطه میشود (مکان ترکیب شونده بازوی منفرد انتی بادی بدونFc)تقریبا 20 nm^2 است .این می تواند معرف یک مکان انتی ژنی باشد (اپی توپ).بنابراین تعداد مکان های ممکن روی ویروس عبارت است از سطح ویروس تقسیم بر سطح مکان ترکیب شونده.سطح یک کره مساوی است با 4π r2 بنابراین برای این ویروس برابر است با 1962 nm2  .با تقسیم این بر 20 بیشینه تعداد مکانهای Fab ممکن 98 است.

 

 

 

 

اگر قطر عامل به دو برابر یعنی 50nm افزایش یابد با استفاده از همان محاسبه ها  تعداد مکانها 392 میشود.یک افزایش دوبرابری دیگر در قطر نتیجه 1468 را می دهد.این ها عوامل کوچکی هستند.اگر محاسبه ها برای عواملی انجام شود که قطرآنها تا 10 برابر افزایش یابد ، برای Fab و کل مولکول IgG ( اتصال بصورت دو ظرفیتی که سطح موثر  60 nm2 میشود) ، داده ها همانند جدول 1 خواهد بود.

شماره ها در جدول 1 نشان میدهد که سطح بصورت یک تابع مربعی ازقطرافزایش میابد. چنین محاسبه ای برپایه این حقیقت است که همه سطح ، انتی ِّژنی ( که به ندرت درست است ) و اینکه مولکولها با بیشترین تعداد متصل میشوند.با این حال بطور تجربی ارقام نسبی نزدیک به تئوری بدست امده است.این در ایمونواسی دارای کاربردهایی است طوریکه می توان مقدار انتی بادی لازم برای اشباع هر عامل را محاسبه کرد یا میزان اتصال انتی بادی را به عنوان تابعی از سطح موجود اندازه گرفت .

از آنجایی که ما وزن مولکولی IgG را میدانیم ( وFab) می توانیم وزن تعدادی از مولکولها را محاسبه کنیم. بنابراین وزن مولکولی IgG=150000 است . با استفاده از عدد اوگادرو(تقریبا 6*10^23)  ما نتایج زیر را بدست می اوریم .

1. 1 گرم از IgG حاوی تقریبا دارای 6*10^23 / 1.5*10^5 = 4*10^18 مولکول است .
2. 1   میلی گرم از IgG تقریبا دارای 4*10^18 / 10^3 = 4*10^15 مولکول است .
3. 1 میکروگرم IgG  تقریبا دارای 4*10^18 / 10^6 = 4*10^12  مولکول است.
4. 1 نانوگرم IgG تقریبا دارای 4*10^18 / 10^9 = 4*10^9 مولکول است .
5. 1 پیکوگرم IgG تقریبا دارای 4*10^18 / 10^12 = 4*10^6 مولکول است .

 

 چنین محاسباتی به ما کمک میکند تا در سطح مولکولی بفهمیم که هنگام روبرو شدن با انتی ژنهای متفاوت درحال مواجه شدن با چه چیزی هستیم.

 

4.2

تعاریف

ممکن است در ارتباط با واژه شناسی ایمونولوژی و سرولوژی چند اشتباه پیش آید.این بخش چند تعریف کاربردی را ارایه میکند که به فهم مکانیسم های الایزا کمک میکند .

 

4.2.1

انتی ژن

انتی ژن ماده ای است که پاسخ ایمنی را در نتیجه تزریق شدن به داخل یک حیوان یا در نتیجه یک فرایند عفونی بر می انگیزد.انتی ژن ها می توانند ساده (مانند پپتیدهایی با وزن مولکولی در حدود 5000) تا پیچیده باشند.انتی بادی ها برای انتی ژنها بطور اختصاصی تولید میشوند.تعریف را می توان اینگونه تعمیم داد که مولکولهایی هستند که هرگونه پاسخ ایمنی اختصاصی شامل ایمنی با واسطه سلولی یا تحمل را برمی انگیزند.

 

4.2.2

مکان انتی ژنی

یک مکان انتی ژنی از نظر ساختاری یک ناحیه مشخص روی یک انتی ژن است طوری که توسط مجموعه ای از انتی بادی ها ومعمولا با استفاده از یک سرم پلی کلونال شناسایی می شوند.

 

4.2.3.

اپی توپ

یک اپی توپ یکسان با مکان انتی ژنی است اما در اینجا یک واکنش با اختصاصیتی بزرگتر تعریف میشود به عنوان مثال با  استفاده از انتی بادی های منوکلونال که مجموعه ای منفرد از انتی بادی ها یک ساختار شیمیایی منفرد را روی انتی ژن شناسایی میکنند.

 

4.2.4

اپی تایپ

اپی تایپ یک ناحیه روی یک انتی ژن است که مجموعه ای از انتی بادی های بسیار نزدیک بهم که ساختارهای شیمیایی مشابه را شناسایی میکنند شناسایی میشوند.( به عنوان مثال انتی بادی های منوکلونال که اپی توپ های همپوشان یا بهم مرتبط را تعریف میکنند).یک اپی تایپ را میتوان به این صورت تعریف کرد که  ناحیه ای است که انتی بادی های با تفاوت اختصاصیتی کم نسبت به یک مکان انتی ژنی یکسان را شناسایی میکند.

 

5.4.2.5

اپی توپ پیوسته

یک اپی توپ پیوسته ازاتمهای پشت سرهم که داخل همان مولکول قرار دارند ایجاد میگردد.چنین اپی توپهایی به نام اپی توپهای خطی نیز نامیده میشوند و معمولا با دناتوراسیون تحت تاثیر قرار نمیگیرند.(شکل 1 ببینید).

4.2.6

اپی توپهای ناپیوسته

یک اپی توپ ناپیوسته از ارتباط بین همه اتمها در نواحی ناپیوسته روی همان مولکول یا از اتمها روی مولکولهای جداگانه ایجاد میگردد.چنین مکانهایی معمولا ماهیت ساختاری دارند.(شکل 2 را ببینید).

 

4.2.7

اپی توپ خطی

یک اپی توپ خطی همانطوری است که یک اپی توپ پیوسته است با اتمهای مشخص در یک توالی خطی (شکل 1 را ببینید).

 

4.2.8

اپی توپ فضایی

یک اپی توپ فضایی از طریق ارتباط بین همه عناصر شیمیایی طوری برقرار میشود که یک ساختار سه بعدی را میسازند و این ساختار سه بعدی اختصاصیت و افینیتی را تعیین میکند.چنین اپی توپهایی معمولا با دناتوراسیون تحت تاثیر قرار میگیرند.(شکل 2 را ببینید).

 

4.2.9

مکان ترکیب شونده انتی بادی

یک مکان ترکیب شونده انتی بادی قسمتی از مولکول انتی بادی است که به طور اختصاصی با یک مکان انتی ژنی ترکیب می شود و این مکان ترکیب شونده انتی بادی از ساختمان دقیق شیمیایی زنجیرهای H و L مولکول انتی بادی تشکیل یافته است.

 

4.2.10

پاراتوپ

یک پاراتوپ قسمتی از مولکول انتی بادی است که با اپی توپ متصل میشود.این تعریف بیشتر منطبق بر انتی بادی های منوکلونال است طوری که یک اختصاصیت منفرد برای یک اپی توپ منفرد تعریف میشود.

 

4.2.11

افینیتی و اویدیتی

افینیتی و اویدیتی با میزان نزدیکی تناسب یک پاراتوپ و اپی توپ ارتباط دارد .از نظر واژگان ترمودینامیک به معنی قدرت طیفی از نیروهای غیر کووالانسی نزدیک به هم است .از نظر ریاضی به عنوان ثابت تشکیل (k,L/mol) است که تحت شرایط تعادل محاسبه میشود.افینیتی به عنوان انرژی بین یک اپی توپ و پاراتوپ منفرد میباشد.انتی سرم ها معمولا دارای جمعیتی از انتی بادی ها هستند که علیه مکان انتی ژنی یکسانی جهت گرفته اند و بخاطر تفاوتشان در میزان دقیق بودن تناسب افینیتی های متفاوتی دارند.انتی سرم با چندین اختصاصیت (به عبارت دیگر اختصاصی به شمار زیادی تعیین کننده روی یک انتی ژن ) را نمیتوان برای افینیتی مورد ارزیابی قرار داد،با این حال انرژی اتصال کلی آنها را با یک انتی ژن درهر سنجش انتخابی میتوان ارزیابی کرد. این اویدیتی سرم است .اویدیتی نمایانگر متوسط انرژی اتصال مجموع تمام افینیتی های یک جمعیت از انتی بادی ها متصل شونده به مکان های انتی ژنی مختلف است.

 

4.2.12

انتی بادی های پلی کلونال

انتی بادی های پلی کلونال محصول سرمی یک حیوان ایمن شده است که دارای انتی بادی های متفاوت بسیاری علیه مخلوط مختلفی از انتی ژنهای تزریق شده است.انتی سرم ،محصول بسیاری از کلون های سلولی پاسخ دهنده است و معمولا در تمام جنبه ها ناهمگون است .این جنبه ها شامل اختصاصیت انتی بادی ها ، کلاس ها و زیرکلاس ها ،تیتر،و افینیتی میباشد.پاسخ به یک اپی توپ منفرد ممکن است از نظر کلون متنوع باشند و انتی بادی ها با افینیتی های مختلف برای یک اپی توپ یکسان ، میتوانند رقابت کنند.این تنوع ها به این معنی است که انتی سرم های پلی کلونال تکرارپذیری تولید ندارند.(شکل 3 را ببینید).

 

4.2.13

انتی بادی های منوکلونال

انتی بادی های منوکلونال از سلولهای منفرد تولید کننده انتی بادی نامیرا شده به وسیله هم جوشی با یک خط سلولی توموری لنفوسیت B جهت تشکیل کلونهای هیبریدوما تولید میشوند.انتی بادی ترشح شده در ماهیت ، تک اختصاصی است و بنابراین یک افینیتی منفرد برای یک اپی توپ مشخص دارد(شکل 4 را ببینید).

 

5

انتی بادی ها

انتی بادی ها گروهی از گلایکوپروتیین ها هستند که در سرم و مایعات بافتی تمام پستانداران وجود دارد.این گروه همچنین به نام ایمونوگلوبولین ها خوانده میشوند (Igs) که نشاندهنده نقش آنها در ایمنی اکتسابی است.تمام انتی بادی ها ایمونوگلوبولین به شمار میروند اما تمام ایمونوگلولولین ها انتی بادی به حساب نمیایند به این معنی که تمام ایمونوگلوبولین های تولید شده در یک پستاندار فعالیت انتی بادی ندارد.پنج کلاس مشخص از مولکولهای ایمونوگلوبولین در بیشتر پستانداران فرادست شناخته شده است.این ایمونوگلوبولین ها شامل IgG ، IgA ، IgM،IgD ، و IgE هستند. این کلاسها از یکدیگر در اندازه ،بار الکتریکی ، محتوای امینو اسید، و محتوای کربوهیدرات فرق دارند. همچنین تفاوت قابل ملاحظه ای (هتروژنیسیتی ) در درون هر کلاس وجوددارد.شکل 5 ساختار پایه پلی پپتیدی مولکول ایمونوگلوبولین را نشان می دهد.

 

5.1

ساختار انتی بادی

ساختار پایه تمام مولکولهای ایمونوگلوبولین ها واحدی از دو زنجیر پلی پپتید سبک (L) یکسان و دو زنجیره پلی پپتیدی سنگین (H) یکسان متصل شده به هم با پیوندهای دی سولفید است .کلاس و زیرکلاس یک مولکول ایمونوگلوبولین توسط نوع زنجیره سنگین آن مشخص میشود . بنابراین در انسان چهار زیر کلاس IgG شامل IgG1 , IgG2 , IgG3 , IgG4 است که زنجیره های سنگینی به نام های 1 ، 2 ، 3  و 4 دارند.تفاوتهای بین زیر کلاس های مختلف در یک کلاس ایمونوگلوبولین منفرد کمتر از تفاوتهای بین کلاس های مختلف است .بنابراین IgG1 بسیار ارتباط نزدیکتری به IgG2 و به همین ترتیب دارد تا به IgA، IgM ، IgD ، یا IgE . معمول ترین کلاس ایمونوگلوبولین IgG است.

مولکولهای IgG از دو زنجیر سبک یکسان با وزن مولکولی 23000 و دو زنجیر سنگین یکسان با وزن مولکولی 53000  ساخته شده است .هر زنجیر سبک به وسیله پیوندهای غیر کووالانسی و نیز با یک پیوند دی سولفید کووالانسی به زنجیر سنگین متصل میشود.در IgG هر جفت زنجیر سبک – سنگین با پیوندهای دی سولفید بین زنجیرهای سنگین به یکدیگر متصل میشوند.این مولکول به شکل Y نمایانگر است با انتهای امینوی زنجیر ها در بالای Y و انتهای کربوکسیل از دو زنجیر سنگین در انتهای شکل Y .یک دایمر از این جفت زنجیر سبک – سنگین ، زیر واحد پایه دیگر ایزوتایپ های ایمونوگلوبولین است .ساختار کلاسهای دیگر و زیر کلاس های آنها در جایگاهها و تعداد پیوندهای دی سولفید بین زنجیرهای سنگین و در تعداد جفتهای زنجیر L-H در مولکول با هم فرق دارند.IgG ،IgE ، وIgD از یک جفت زنجیر L-H تشکیل شده اند .IgA ممکن است یک ، دو یا سه جفت زنجیر سبک – سنگین داشته باشد.IgM (نوع سرمی)پنج جفت زنجیر سبک – سنگین دارد در حالی که IgM متصل به غشا یکی دارد.در اشکال پلی مری IgA و IgM جفتهای زنجیر سبک و سنگین که با پیوندهای دی سولفیدی به هم نگاه داشته شده اند با یک پلی پپتیدی به نام زنجیر J اتصال بیشتری می یابند.

در هر دو زنجیرهای سبک و سنگین در بخش انتهایی N توالی ها از یک پلی پپتید تا پلی پپتید دیگربسیار فرق میکند.برعکس در بخش انتهایی C از هر دو زنجیرهای سبک و سنگین توالی ها یکسان است. به این ترتیب این دو قطعه از مولکول را به عنوان نواحی متغیر و ثابت در نظر میگیرند. برای زنجیر سبک ناحیه متغیر (v)  در حدود 110 باقی مانده امینو اسید و در ناحیه ثابت (c) از زنجیر سبک نیز بطوری مشابه در حدود 110 امینو اسید دارد.

 

ناحیه متغیر از زنجیر سنگین (VH) در حدود 110 باقی مانده امینو اسید درازا دارد اما ناحیه ثابت از زنجیر سنگین (CH) در حدود 330 باقیمانده امینواسید درازا دارد.بخشهای انتهایی N از هردو زنجیر سنگین و سبک تشکیل دهنده مکان های متصل شونده به انتی ژن در مولکولIg هستند.هتروژن بودن توالی های امینواسید موجود در داخل نواحی متغیر در زنجیرهای سنگین و سبک مسول تنوع بزرگ اختصاصیت به انتی ژن در مولکولهای انتی بادی است. برعکس نواحی ثابت از زنجیر سنگین بخشی از مولکول را تشکیل میدهند که عملکردهای مشترک بین تمام انتی بادی های یک کلاس مفروض را بر عهده دارند .

شکل 5 نشان میدهد که باید دو مکان یکسان متصل شونده به انتی ژن ( در مورد IgM سرمی و IgA ترشحی تعداد بیشتری وجود دارد) وجود داشته باشد ،به این ترتیب مولکولIg  پایه به شکل Y  دو ظرفیتی است .این دو ظرفیتی بودن به انتی بادی ها اجازه میدهد که انتی ژنها دارای دو یا چند اپی توپ یکسان را به طور متقاطع به هم متصل کند.شاخص های انتی ژنی که با یک فاصله از هم جدا شده اند می توانند توسط یک مولکول انتی بادی متصل شوند.

مکان ترکیب شونده با انتی ژن (مکان فعال) شکافی بین نواحی متغیر از جفت زنجیر سبک و سنگین است .اندازه و شکل این شکاف بخاطر تفاوتهایی که در ارتباط نواحی  VLو  VH است ونیز تفاوتهایی که در تغییرات توالی امینواسید های این نواحی وجود دارد ، متفاوت است.بنابراین اختصاصیت انتی بادی از مکمل بودن مولکولی بین گروههای تعیین کننده (اپی توپها ) روی مولکول انتی ژن و باقی مانده های امینو اسید موجود در مکان فعال حاصل میشود.

یک مولکول انتی بادی ساختار سه بعدی یکتایی دارد.با این حال یک مولکول انتی بادی منفرد این توانایی را دارد که با طیفی از انتی ژنهای مختلف ترکیب شود.این پدیده به نام چند اختصاصیتی نامیده میشود.بنابراین انتی بادی می تواند با شاخص انتی ژنی القا کننده یا با یک شاخص جداگانه با ساختارهای مشابه (انتی ژن واکنش متقاطع دهنده)ترکیب گردد.کمپلکس های پایدار انتی ژن – انتی بادی جدای از جور شدن کامل هنگامی تشکیل میشوند که تعداد کافی از برهمکنش های کوتاه برد بین هر دو وجود داشته باشد .این یک مشکل برای متخصص ایمونواسی است و باید مطمین بود از اینکه کاربر در حال سنجش انتی ژن درست یا انتی ژن مورد نظر است بنابراین طراحی دقیق کنترلهای منفی و مثبت ضروری است.

 

5.1.1

هضم انتی بادی

شکل 6 هضم IgG را با استفاده از انزیم های پاپایین یا پپسین نشان میدهد.پروتئولیز ملایم Ig طبیعی با پاپایین در نواحی لولا از زنجیره سنگین IgG را به سه قطعه خواهد شکست .

دو تا از این قطعات یکسان هستند و قطعه متصل شونده به انتی ژن یا Fab خوانده می شوند.هر Fab از نواحی متغیر ونواحی ثابت زنجیر سبک و قسمت متغیر از نواحی ثابت (دامین ChI) زنجیره سنگین تشکیل شده است.بنابراین هر Fab یک مکان متصل به انتی ژن را حمل میکند.

 

قطعه سوم تشکیل شده از بقیه نواحی ثابت زنجیره سنگین که به راحتی قابل کریستالیزه شدن است و قطعه کریستالیزه شونده یا Fc نامیده میشود.

هضم با پپسین، Fc را از مولکول جدا میکند اما پل دی سولفیدی بین نواحیFab را باقی میگذارد.این مولکول حاوی هر دو مکان ترکیب شونده با انتی ژن و دو ظرفیتی است.

 

5.1.2

کلاس های انتی بادی

از نظر ساختاری  پنج کلاس ایمونولوژیکی (ایزوتایپ) با اختلافاتی که در نواحی ثابت زنجیر سنگین دارند قابل تشخیص هستند(بطور عمده در بخشFc ) .این کلاس های زنجیر سنگین ،کلاس های Ig مربوطIgA،IgG، IgD ، IgE و IgM را تعریف میکنند.بعضی از کلاسها به زیر کلاسهای بیشتری قابل تقسیم هستند.

به علاوه ، دو نوع اصلی از زنجیر سبک برپایه تفاوتهایی در ناحیه ثابت Cl وجود دارد و کاپا (k) و لامبدا (λ) نامیده میشوند.Ig پستانداران مختلف به نظر میرسد که همه به همین شکل باشند.با این حال نام و تنوع زیرکلاس ها ممکن است در تمام گونه های بررسی شده یکسان نباشد، برای مثال موش ها IgG1، IgG2a ، IgG2b ، IgG3 و گاوها IgG1 ، IgG2 دارند.

 

5.2

تولید انتی بادی در پاسخ به تحریک انتی ژنی

انتی بادی های تولید شده در پاسخ هومورال به تحریک انتی ژنی از نظر اختصاصیت ناهمگون بوده و ممکن است شامل تمام کلاس های Ig ها باشند.این پاسخ ناهمگون به این خاطر است که بیشتر انتی ژن ها چندین شاخص انتی ژنی دارند که سلولهای B مختلفی را فعال میکنند.بنابراین سرم هر پستانداری (مهره داری) حاوی یک مخلوط ناهمگونی از مولکولهای Ig مختلف است .اختصاصیت این مولکولهای Ig تاریخچه مواجهه موجود زنده با انتی ژن را منعکس میکند.

اولین انتی بادی که در پاسخ به اولین مواجهه با یک ایمونوژن تولید میشود IgM است .وقتی که ایمونوژن بطور مداوم حضور دارد یا میزبان (پستاندار) دوباره در معرض ایمونوژن قرار میگیرد علاوه برIgM دیگر کلاسهای انتی بادی ممکن است تولید شوند .محفظه های بدن که در آن ها ایمونوژن ارایه میشود تعیین کننده ایزوتایپ غالب انتی بادی تولید شده است(مثلا IgA در دستگاه معدی –روده ای بیشتر تولید میشود).بطور کلی مواجهه اولیه با یک ایمونوژن در ابتدا تولید IgM را تحریک میکند و به دنبال آن IgG تولید میشود ،همانطورکه در شکل 7 نشان داده شده است.

اگر هیچ مواجهه دیگری رخ ندهد یا ایمونوژن توسط پستاندار پاک سازی شود سطح کمی از IgM و IgG قابل شناسایی است.اگر مواجهه دوباره رخ دهد یک پیک مشابه از انتی بادی IgM تولید میشود که با همان کینتیک مشابه با پاسخ IgM اولیه کاهش می یابد اما پاسخ IgG نه تنها سریعتر است (در گذر زمان ) بلکه به سطوح سرمی بالاتری نیز می رسد و برای مدت زمان بیشتری هم دوام می آورد .این پاسخ IgG به مواجهه دوباره به عنوان پاسخ خاطره ای نامیده میشود. این پدیده در شکل 7 مثال زده شده است .

 

در مواردی که انتی ژنهای پیچیده وجود دارد مانند بیماریهای عفونی ، دوزاژ ( سطح عفونت) نوع انتی ژن ( ویروسی ، باکتریایی ، تک یاخته ای ، کرمی) ، راه عفونت ( دهانی ، تنفسی ، جلدی) و گونه پستانداری که عفونی شده ( گاو ، خوک ، شتر، انسان ) بر درجه و سرعت جایگزینی IgG با IgM تاثیر دارند .

این ملاحظات برای یک متخصص ایمونواسی که روی تشخیص بیماریهای عفونی پستانداران کار میکند، حیاتی است و برنامه ریزی و دقت زیادی باید قبل از چنین سنجش های ایمنی انجام شود.همچنین در این مرحله باید توجه داشت که عوامل مختلف بیماری های عفونی می توانند ایزوتایپ های مختلفی از انتی بادیها را تحریک کنند.برای مثال پاتوژنهای ویروسی خاصی به طور غالب ساخت IgM آگلوتینه کننده،پلی ساکاریدهای باکتریایی ساخت انتی بادی های IgM( و IgG2 درانسان )و عفونتهای کرمی ساخت انتی بادی IgE را تحریک میکنند.

بطور کلی می توان بیان کرد که طی ایجاد ایمنی در برابر عوامل بیماری عفونی انتی بادی های تولید شده قادر هستند انتی ژن ها را با برهم کنش بهتر انتی ژن – انتی بادی بهتر شناسایی کنند .چند اختصاصی بودن مولکولهای انتی بادی ) یعنی توانایی ترکیب شدن با تعدادی از اپی توپ های دارای ساختار مولکولی مشابه ) نه تنها وابسته به ناهمگون بودن اپی توپ مورد نظر است بلکه به ساختار مولکولی مکانهای واکنش دهنده با انتی ژن ( پاراتوپ ها ) روی مولکولهای انتی بادی هم بستگی دارد.

 

5.3

افینیتی و اویدیتی

انرژی اتصال بین یک مولکول انتی بادی و یک شاخص انتی ژنی افینیتی نامیده میشود . بنابراین انتی بادی با پاراتوپهایی که اپی توپ ها را بطور عالی شناسایی میکنند افینیتی بالا(جورشدن خوب ) برای انتی ژن مورد نظر دارند درحالی که انتی بادیها با پاراتوپهایی که اپی توپ ها را نه چندان عالی شناسایی میکنند افینیتی پایین ( جورشدن ضعیف) دارند.انتی بادیها با افینیتی پایین که جور شدن آنها با انتی ژن کمتر از جور شدن در سطحی عالی است پیوندهای غیر کووالانسی کمتری درکمپلکس برقرار شده دارند و قدرت اتصال نیز کم خواهد بود همانطور که در شکل 8 نشان داده شده است.

با ایمونوژنهای ساده که دارای اپی توپهای کمی هستند همانطور که پاسخ انتی بادی به این ایمونوژن پیش میرود ( در پاسخ ) شناسایی آن توسط انتی بادی نیز بهتر و نزدیکتر خواهد شد یعنی انتی بادیهای با افینیتی پایین با انتی بادی های با افینتی بالا جایگزین خواهد شد که سبب می شود بر هم کنش بین انتی ژن و انتی بادی پایدار تر شود.انتی بادی های تولید شده در اواخر عفونت بطور کلی دارای افینتی بالاتری نسبت به انتی بادی های تولید شده در اوایل عفونت هستند .به این ترتیب انتی باد یها ی IgG تولید شده در پاسخ به رویارویی دوباره دارای افینتی بالاتری نسبت به آنتی بادی های IgG تولید شده در مواجهه اولیه دارند .

در یک نمونه سرمی که درآن تولید انتی بادی پلی کلونال در پاسخ به تحریک انتی ژنی تولید شده است تنوعی از افینیتی ها دربین انتی بادی ها وجود دارد.اتصال (جور شدن ) انتی بادی ها به انتی ژن مربوط متغیر خواهد بود و انتی باد یها ی موجود در نمونه سرم ،با قدرتهای اتصال متفاوت به آنتی ژن متصل میشوند.بنابراین یک انتی ژن نه تنها می تواند ایزوتایپ های مختلف انتی بادی را تحریک کند بلکه انتی بادی با افینتی های مختلف را برای شاخص انتی ژنی برانگیزد.اویدیتی را میتوان به عنوان جمع تمام افینیتی های مختلف بین انتی بادی های ناهمگون موجود در یک سرم و مکان های انتی ژنی مختلف (اپی توپها ) تعریف کرد.درک این مطلب مهم است که اویدیتی یک سرم ممکن است با رقت سازی تغییرکند چون ممکن است جمعیت معینی از انتی بادی ها با رقت از محیط خارج شود.

به عنوان مثال ممکن است سرمی داشته باشیم حاوی مقدار کمی انتی بادی که افینیتی بالایی برای یک انتی ژن پیچیده ویژه دارد و حاوی مقدار بالا یی از انتی بادی با افینیتی پایین نیز باشد. تحت شرایط ایمونواسی که سرم زیاد رقیق نمی شود ،رقابت برای مکان های انتی ژنی بین انتی بادی های با افینیتی بالا و پایین را داریم و انتی بادی های با افینیتی بالا بطور ترجیحی بیشتر واکنش میدهند.با رقیق سازی ،غلظت انتی بادی های با افینیتی بالا کاهش می یابد تا اینکه تنها انتی بادی های با افینیتی پایین باقی میماند.این مشکلات هنگام مقایسه انتی ژنها از نظر فعالیت افتراقی آنها با انتی سرم های مختلف اهمیت پیدا میکند .رقت هر سرم می تواند توانایی آنرا در تشخیص بین انتی ژنها بخاطر دینامیک جمعیت انتی بادی ناهمگون(غلظتها و افینیتی نسبی مولکولهای انتی بادی منفرد) تحت تاثیر قرار دهد.

چنین مشکلاتی در رابطه با کیفیت و کمیت در مورد انتی بادی های منوکلونال وجود ندارد چون طبق تعریف مولکولهای Ig از نظر جمعیتی یکسان هستند.تمام آنها افینیتی یکسان دارند و بنابراین اویدیتی آنها با افینیتی برابر است.بنابراین یک مجموعه از این آنتی بادی ها همانند یک مولکول منفرد در جمعیت واکنش میدهد.با رقیق سازی مجموعه منوکلونال هیچ تغییری در افیینیتی /اویدیتی سرم وجود ندارد و تغییر در واکنش بین منوکلونال انتی بادی و انتی ژن ناشی از تغییر در انتی ژن می باشد.

شکل 9 واکنش متقاطع بین سرم ها و انتی ژنهای مختلف را نشان میدهد.در اینجا واکنشهای اختصاصی زمانی رخ می دهند که تمام انتی بادی ها بهترین جور شدن را داشته باشند.وقتی دو انتی ژن در انتی ژن مشابهی سهیم باشند واکنش متقاطع دیده میشود.دو مکان غیر یکسان نیز ممکن است در واکنش متقاطع همکاری داشته باشند.اگرتمام انتی بادی ها هیچ یک از انتی ژنهای موجود را نشناسند هیچ واکنش رخ نمی دهد.فهمیدن وجود تغییرات در 1 – ساخته شدن ایزوتایپ های انتی بادی ها  و 2- افینیتی و بلوغ افینیتی انتی بادی ها هنگام طراحی ایمونواسی  برای عوامل بیماری های عفونی مزمن از نظر دوره زمانی، مهم است.

همینطور که انتی ژن به داخل محفظه ها ی مختلف بدن پستانداران عرضه میشود تولید ایزوتایپ های مختلف انتی بادی ها را تحریک میکنند.پاسخ های انتی بادی ها ی محلی در دستگاه معدی روده ای و درخت تنفسی غالبا ایزوتایپ های IgA است در حالی که در دیگر محفظه های اصلی  غالبا IgG ( یا IgM) است .مکان های معینی در بدن (مثلا بیضه ها ) از نظر ایمونولوژیکی محصور شده اند و پاسخ های انتی بادی کمتری به ایمونوژن ها میدهند.بیشتر بیماری های عفونی از طریق ذرات معلق ، تماس تزدیک یا ناقلین منتقل میشوند بنابراین راه ورود آنها متغیر است .بعلاوه مکان نهایی آنها ممکن است از نقطه ورود آنها دور باشد.

. بعضی از پاتوژنها قادر به تقسیم داخل میزبان هستند درحالی که بقیه قادر به تقسیم داخل میزبان پستاندار نیستند ( مانند کرمها ).

 

5.4

تولید انتی بادی در پاسخ به ایمنی زایی / واکسیناسیون

در برابر عوامل عفونی میتوان فرد را یا بصورت ایمنی زایی غیر فعال یا ایمنی زایی فعال مقاوم کرد.بطور کلی اثر ایمنی زایی توسط انتی بادی ها انجام میشود و بنابراین اثر ایمنی زایی را می توان با سنجش میزان ایمنی پیگیری کرد.

 

5.4.1

ایمنی زایی غیر فعال

ایمنی زایی غیر فعال با انتقال انتی بادی ها از یک میزبان مقاوم به یک میزبان حساس انجام میشود.انتی بادی های منتقل شده بصورت غیر فعال یک مقاومت موقتی اما فوری را در برابر عفونت می دهد اما به تدریج توسط میزبان حساس کاتابولیزه میشوند.وقتی حفاظت غیر فعال ضعیف میشود دریافت کننده دوباره به عفونت حساس میشود . انتی بادی ها بصورت غیرفعال می تواند با عبور از جفت آنطور که در نوزادان رخ میدهد توسط دریافت کننده اخذ شود یا با تزریق انتی بادی های تخلیص شده از یک دهنده مقاوم به یک دریافت کننده حساس منتقل شود.

 

5.4.2

ایمنی زایی فعال

ایمنی زایی فعال با تجویز انتی ژنهای عوامل عفونی به افراد انجام میشود که پاسخ به صورت تولید انتی بادی است که عوامل بیماری عفونی را هنگام رویارویی خنثی میکند .رویارویی دوباره با چنین انتی ژنهایی به دنبال ایمنی زایی فعال منجر به پاسخ ایمنی خاطره ای خواهد شد که انتی بادی ها یا سلولهای افکتور تولید شده قادرند اثر یا خود عوامل برانگیزنده را خنثی یا نابود کنند.چنین انتی باد یهایی ، انتی باد یها ی محافظت کننده و انتی ژنهای مکمل آنها را انتی ژنهای محافظت کننده می نامند.محافظت ایجاد شده با ایمنی زایی فعال ، همانند ایمنی زایی غیر فعال فوری نیست، چون سیستم ایمنی نیازمند زمان قابل ملاحظه ای است تا انتی ژنها پردازش شده و انتی باد یها ی محفاظت کننده تولید شوند.با اینحال مزیت ایمنی زایی فعال این است که دوام دار است و تحریک دوباره با همان انتی ژنهای موجود در پاتوژنها  منجر به پاسخ خاطره ای می شود.مهم است که بدانیم ایمنی ایجاد شده در برابر پاتوژنها در ایمنی زایی فعال تنها به وسعت طیف انتی ژنی فراورده ای است که برای ایمنی زایی استفاده شده است.محفاظت می تواند با استفاده از شیوه های مختلف در فرمولاسیون واکسن ها ایجاد شود.

 

5.4.3

واکسنهای زنده

واکسن های زنده را با تضعیف عبور عوامل (مانند ویروس ها ) پاتوژن از یک میزبان غیر معمول تولید میکنند تا اینکه برای حیوانات واکسینه شونده غیر پاتوژن شوند.معمولا اینها واکسن های خوبی هستند چون همان تحریک انتی ژنی را ایجاد میکنند که عامل بیماری میکند. مشکل بازگشت به عامل پاتوژن طبیعی وجود داشته و مقداری تکثیر عامل پاتوژن معمولا رخ میدهد.

 

5.4.4

واکسن های اصلاح شده

واکسن ها را میتوان رشد داد و آنگاه از نظر شیمیایی اصلاح کرد(مثلا کشتن با گرما ، اصلاح نوکلئیک اسیدها (جهش یا فته ها) یا تیمار با فرمالدهید).این ها بالقوه واکسن های خوبی هستند چون در آنها طیف کامل انتی ژنی وجود دارد.جرم انتی ژنی باید بالا باشد چون تکثیری وجود ندارد تا سیستم ایمنی را به چاش بکشد.واکسیناسیون های چندباره لازم است تا سطح انتی بادی را بتوان بالا برد.

 

5.4.5

انتی ژنهای خالص شده

انتی ژنهای محفاظت کننده می توان شناسایی کرد و به صورت پروتیین ، پلی پپتید و پپتید به عنوان ایمونوژن و معمولا همراه با ادجووانت ها بکار برد.معمولا این واکسنها یه خوبی  طیف انتی ژن کامل نیست .مزیت اینها ،ساخت در مقیاس بزرگ با روشهای شیمیایی ( به شکل پپتید ها ) و غیر عفونی بودن آنها است.

 

5.4.6

محصولات فن اوری DNA

ژنهای تولید کننده ایمونوژنهای ویژه را میتوان داخل عاملهای تکثیر یابنده طوری درج کرد که محصولات آنها بیان شود.شیوه های نوین شامل استفاده از ویروسهای پستانداران ،ویروسهای حشرات (بیان به وسیله باکولوویروس) ، مخمرها و ایکولای است.

 

5.4.7

تعمیم ها

بیشتر واکسن ها به شیوه تزریق های زیر جلدی یا درون عضلانی تجویز میشوند.هنگام واکسیناسیون شمار زیادی از حیوانات  تکنیک های دیگری مانند استفاده از تزریق کننده های با فشار بالا ممکن است بکار گرفته شود.پرواضح است که خطر تجویز موجودات و انتی ژنهای ناخواسته یا الوده کننده باید به حداقل برسد پس به این ترتیب تجویز استریل واکسن ها لازم است .واکسیناسیون زیر جلدی یا درون عضلانی باید تمام ایزوتایپ های انتی بادی را القا کند چون حقیقت این است که انتی ژنهای تحریک کننده قادر به انجام اینکار هستند.بنابراین یک متخصص سنجش ایمنی باید در نظر بگیرد که کدام یک از سنجشها شامل سنجش کل انتی بادیها ، سنجش ایزوتایپهای اختصاصی، یا سنجش میزان پاک سازی انتی ژن در ارزیابی اثر واکسیناسیون بکار رود.

بعضی از انتی ژنها ممکن است از طریق دهان تجویز شوند ( مانند واکسنهای پولیومیلیت در انسان ) یا با وارد کردن در غذا یا آب آشامیدنی ( در مرغداریها) یا از طریق تنفس یک واکسن افشانه ای ( برای بیماریهای دستگاه تنفسی).در این موردها تولید انتی بادی های ناحیه ای برای پیش گیری از ورود پاتوژنها از طریق دستگاه معدی روده ای یا سدهای درخت تنفسی باید تحت پایش قرار گیرد.متخصص ایمونواسی باید تصمیم بگیرد که آیا سنجش ایزوتایپهای خاص انتی بادی به ویژه IgA اطلاعات دقیق تری در ارتباط با مزیت واکسیناسیون میدهد یا سنجشی که تمام انتی بادیها را اندازه میگیرد.

در بعضی موارد که عامل بیماری عفونی اندمیک است و واکسیناسیون به خصوص در نوزادان ضرورت دارد تشخیص مفید بودن اثر واکسیناسیون سخت یا غیر ممکن خواهد بود چون سطح باقیمانده ای از انتی بادی ممکن است در جمعیت غیر واکسینه وجود داشته باشد.هنگامی که سنجش ها برای تعیین وضعیت ایمنی گروه زیادی طراحی میشوند این عوامل را باید به خاطر داشت.

5.5

تولید انتی بادی در پاسخ به عوامل عفونی

فراتر از هدف این کتاب است که پاسخ های ایمنی هومورال تولید شده در پستانداران را در پاسخ به تعدادی از عوامل بیماری عفونی مانند ویروس ها ، باکتریها ، قارچ ها ، پروتوزوا ها ، کرمها و ارتروپود ها تشریح کنیم.چنین اطلاعاتی را میتوان از کتابهای متن و مقالات مروری تخصصی بدست آورد.این بخش به اصول عمومی ارتباطات میزبان – انگل با تمرکز خاص بر تولید انتی بادیها علیه پاتوژنها می پردازد.همانطور که گفته شد بیشتر بیماریهای عفونی  بصورت ذرات ، تماس نزدیک ، یا ناقلین منتقل میشوند و مکان نهایی آنها ممکن است از نقطه ورود آنها دور باشد.بنابراین این پاتوژنها چندین اندام را درگیر میکنند.بطور مشابه بسیاری از پاتوژنها اما نه همه آنها ظرفیت آنرا دارند که داخل پستانداران تقسیم شوند و در چنین مواردی تعداد و مقدار انتی ژنهای تولید شده طی زمان افزایش می یابد و متناسب با تعداد پاتوژنها در زمان نمونه برداری خواهد بود.هنگامی که پاتوژنها تقسیم نمی شوند یا در میزبان تکثیر نمی یابند مقدار انتی ژنهای تولید شده مستقیما متناسب با دوز عفونی است.به این ترتیب در طراحی سنجش عوامل بیماری ها ی عفونی متخصص سنجش ایمنی باید به این نکته توجه داشته باشد که غلظتهای بالا یا پایین انتی ژنها یا انتی بادی ها قرار است اندازه گیری شود .هنگامی که تیترهای انتی بادی کمتر از 1/50 مورد انتظار است رقتهای سرمی کمتر از1/50  یا احتمالا کمتر از 1/10 برای ازمایش سرم باید بکار گرفته شود.دانش قدیمی یک سیستم میزبان –انگل خاص ثابت کرده است که درطراحی انزیم ایمونواسی اختصاصی تر و حساس تر ارزشمند نبوده است.

 

اگرچه مکانیسم های غیر ایمونولوژیکی بسیاری در حذف  پاتوژنها از بدن (مانند لیزوزیم ، پروتیین ها ی متصل شونده به آهن ،میلوپراکسیداز، لاکتوپراکسیداز ، کمپلمان ، پپتیدهای بازی و پروتیین ها ) وجود دارد اما بطور کلی شناخته شده است که سیستم ایمنی نقش حیاتی در کنترل و نابودی پاتوژنها بازی میکند.به این دلیل اندازه گیری انتی بادی یا انتی ژن با سنجش های حساس ، مانند الایزا ، شاخص مفیدی را برای ارزیابی وضعیت سیستم ایمنی فراهم میکند.وقتی یک عامل عفونی وارد بدن پستاندار میشود اجزای اولیه که به عنوان خارجی شناخته میشود  اجزای سطحی آن پاتوژن میباشند.این رویارویی میزبان /پاتوژن یک نقش حیاتی در کنترل بیماری ها ی عفونی بازی میکند نه تنها با دخالت در تحریک پاسخ اولیه ایمنی هومورال بلکه با دخالت در واسطه گری ایجاد پاسخ های ایمنی حفاظت کننده .پاسخ های ایمنی که شمار پاتوژن را به وسیله لیزکردن ، اگلوتیناسیون یا فاگوسیتوز وپاسخهایی که بار انتی ژن را به طور طبیعی کاهش میدهند به عنوان پاسخهای محفاظت کننده در نظر گرفته میشوند. انتی بادی هایی که علیه اپی توپهای خاصی روی پاتوژنها هدایت شده اند توسط متخصصین ایمونواسی به منظور بررسی ارتباط پاسخ های محافظت کننده و بهبود علایم بالینی مورد پایش قرار میگیرند.با این حال نگاه عمیق به پایه مولکولی چنین برهم کنشهایی قبل از اینکه سنجش ایمنی برای اثبات پاسخ های حفاظت کننده طراحی شود، لازم است(مثلا دانش ایمونوشیمی مولکولهای قرار گرفته در سطح و اپی توپ های آنها ، دانش ایزوتایپهای انتی بادی اختصاصی که این پاسخ ها را واسطه گری میکنند).ازآنجایی که عوامل بیماری های عفونی تولید انتی بادی را تحریک میکنند ،این انتی بادیها برای یک متخصص سنجش ایمنی در تشخیص مواجهه با پاتوژنها مفید میباشد.

 

ما دیده ایم هنگامی که انتی ژنهای پاتوژنها توسط میزبان شناسایی میشوند یک پاسخ انتی بادی در ابتدا ایزوتایپ IgM و به دنبال آن ایزوتایپ IgG رخ میدهد،ونیز افزایش در افینیتی در طول زمان در هر دو ایزوتایپ رخ میدهد.هنگامی که تعدادی ایزوتایپ انتی بادی در پاسخ به عفونت تولید میشوند این تنوع ایزوتایپی می تواند در تعیین مزمن بودن عفونت بکار رود چون ایزوتایپ انتی بادی IgM بطور طبیعی قبل از ایزوتایپ انتی بادی IgG ظاهر میشود.بطور مشابه افزایش سطح انتی بادی می تواند مشخص کننده عفونتهای جاری یا بدتر شدن عفونتها باشد درحالی که تیترهای انتی بادی کاهش یابنده مشخص کننده عفونتهای گذشته یا کنترل موفق عفونت جاری باشد .درغیاب انتی بادی در حال گردش ازاد و قابل تشخیص ، تشخیص انتی ژن ازاد یا کمپلکسهای ایمنی در  حال گردش توسط الایزا انجام میشود.هنگامی که انتی بادی های اختصاصی به انتی ژنهای یک پاتوژن بکارمیرود تا حضور انتی ژن ازاد را در نمونه مورد ازمایش تشخیص دهد ، یک هم خوانی مستقیم بین مثبت بودن الایزا و عفونت جاری باید انجام شود.وقتی مکانیسم های حفاظت کننده رخ میدهد تخریب انتی ژن نتیجه آن خواهد بود.این کار با ازاد سازی اجزای داخلی انتی ژنیک پاتوژن وتحریک تولید انتی بادی های اختصاصی انجام میشود.بنابراین تخریب پاتوژن ها منتهی به تولید انتی باد یها علیه ذخایر انتی ژنی عرضه شده در سطح و هم انتی ژنهای داخلی پاتوژن می شود.بخاطر مشترک بودن بعضی انتی ژنهای داخلی (مثلا انزیم ها) اجماع نظردر این است که انتی ژنها یا پاتوژنهای اختصاصی تر ( بجز اندوتوکسین ها )  بعضی دریک زمان در سطح بیان می شوند وبعضی دیگر طی پیشرفت عامل عفونی.موزاییک انتی ژن عرضه شده در سطح بطور طبیعی پیچیدگی کمتری از موزاییک انتی ژنی درونی پاتوژنها دارد.

 

5.5.1

اثر انتی بادی در عفونت ویرووسی

ویروس ها باید وارد سلول شوند تا تکثیر یابند چون آنها فاقد ماشین بیوشیمیایی در تولید پروتیین ها ومتابولیزه کردن قندها هستند.بعضی از ویروس ها همچنین فاقد انزیم های لازم برای تکثیر نوکلئیک اسیدها هستند.تعداد ژنهای حمل شده توسط ویروس ها از 3 تا 250 فرق میکند و این قابل ذکر است که این محتوا در مقایسه با کوچکترین باکتری چقدر کوچک است.

بیماری هایی که توسط ویروس ها ایجاد میشوند متنوعند و شامل حاد ، برگشت کننده ، مخفی ( غیرفعال اما می تواند دوباره فعال شود)، و تحت بالینی میباشد. پاسخ های ایمنی طیفی از ایمنی کاملا ناموجود تا ایمنی در تمام طول عمر را شامل می شود.عفونت حاد بیشترتوسط متخصص سنجش ایمنی که علاقمند به بیماری های حیوانات است مورد توجه قرار میگیرد اما در نظر داشته باشید که تمام دانش یک بیماری خاص را باید در اختیار داشت تا سنجشی را مرتبط با مشکلی خاص طراحی کرد .

از آنجایی که سطوح بیرونی (کپسیدها ) ویروس ها حاوی انتی ژن است ، علیه این انتی ژنها و انتی ژنهای پوششی است که انتی بادی های ضد ویروسی تولید میشوند.اولین خط دفاع (جدای از اینترفرون) در شرایطی که ویروسها در پلاسما و مایعات بافتی (منتقل شده به وسیله وکتورها ) حضور دارند انتی بادی ها از نوع  IgM است یا IgG ، و در جایی که ویروسها در سطح اپی تلیال حضور دارند(از هوا امده ، یا تماس نزدیک ) انتی بادی ها از نوع IgA ترشحی هستند.بعضی از ویروس ها که کاملا روی سطح اپی تلیال تکثیر می یابند ( مثلا درخت تنفسی ، دستگاه روده ای معده ای ، دستگاه ادراری تناسلی) وفاز ویرمی ندارند با IgA ترشحی کنترل میشوند.انتی بادی ها ویروس های خارج سلولی را نابود می کنند و یاعفونت سلول توسط ویروس ها را با مسدود کردن چسبیدن آنها به گیرنده های سلولی یا نابود کردن سلولهای عفونی شده با ویروس ها را کنترل میکنند.

 

5.5.2

اثر انتی بادی در عفونت باکتریایی

نقش انتی بادی در مبارزه با عفونت باکتریایی متنوع است .انتی بادی ضد انتی ژنهای سطح باکتریایی (فیمبریا ، لیپوتئیکوئیک اسید و بعضی کپسولها ) از چسبیدن باکتری ها به غشای سلول میزبان با مسدود کردن مکانهای گیرنده جلوگیری میکند.انتی بادی می تواند اگزوتوکسین های باکتریایی را خنثی کند( احتمالا با مسدود کردن برهم کنش بین اگزوتوکسین و مکان گیرنده ).بطور طبیعی انتی بادی های IgG مسول خنثی سازی توکسین ها هستند.انتی بادی ضد انتی ژنهای کپسول میتواند خصوصیات ضد فاگوسیتی کپسول را خنثی کند یا در موجوداتی که فاقد کپسول هستند انتی بادی های ضد انتی ژنهای سوماتیک ممکن است عملکرد مشابهی داشته باشند.انتی باد یها ی IgG به عنوان اپسونین های موثرتری نسبت به  IgM در غیاب سیستم کمپلمان عمل میکنند. IgG ایزوتایپ انتی بادی موثرتری در حضور کمپلمان است .بنابراین انتی بادی های IgM در القای لیز با واسطه کمپلمان و اپسونیزاسیون باکتریایی قبل از فاگوسیتوز موثرتر هستند.انتی بادی میتواند مکانیسم ها و گیرنده های باکتریایی را مسدود کند ( مثلا در مورد ترکیبات چلات کننده اهن) ، پس زننده های ایمنی ( که با فاگوسیتوز طبیعی تداخل میکنند) را خنثی کنند ، و انتشار عواملی را که تهاجم را تسهیل میکند خنثی کنند ( مثلا انزیم ها ، هیالورونیدازها ).

5.5.3

اثر انتی بادی درعفونت پروتوزوایی

بطور کلی انتی بادی ها انگل هایی را که در جریان خون  و مایعات بافتی وجود دارند در کنترل دارند و تنها هنگامی که انگل داخل سلولی شد غیرموثر میشوند.به این ترتیب اهمیت انتی بادی وابسته به عفونت تحت مطالعه است.حضور اشکال انگلی بصورت کیست موثر بودن انتی بادی را کاهش میدهد ( مثلا توکسوپلاسما ، انتاموبا، ژیاردیا) .بسیاری از انگلهای پروتوزوایی در میزبان پستاندار مراحلی از رشد را طی میکنند که از نظر مرفولوژیکی ، شکل کاملا متفاوت و مشخصی دارند.چنین اشکال رشد یافته ای اغلب همراه با انتی ژنهای سطحی خاص هریک از مراحل رشد است.

انتی بادی ها می توانند مستقیما انگل ها را صدمه بزنند ،لیز را القا کنند ،کمپلمان را فعال کنند ،اشکال خارج سلولی را اگلوتینه کنند ،کشتن سلول با واسطه انتی بادی را تحریک نمایند و ورود آنها به سلول میزبان را مسدود کنند. ایزوتایپ های انتی بادی IgM ، IgG،  و IgA در این واکنش ها درگیر هستند.اختصاصیت ایزوتایپی نه تنها بستگی به محفظه ای از میزبان که توسط انگل برای اقامت انتخاب شده است ( مثلا درخت تنفسی ، دستگاه معده ای روده ای ، دستگاه ادراری تناسلی (IgA)  ، جریان خون ،بافت لنفوئید (IgM،IgG) ) دارد بلکه بستگی به انتی ژنهای بیان شده طی مراحل تکاملی مختلف و مزمن بودن آنها نیز دارد).

انگلهای پروتوزوایی می توانند عفونت های مزمن را در پستانداران ایجاد کنند و بنابراین مقادیر زیادی از انتی بادی (IgM+IgG) در پاسخ به عفونت تولید میشود.سطوح خارجی و انتی ژنهای داخلی در کنترل عفونتهای پروتوزوایی و بسیاری از مکانیسم های موثر و حفاظت کننده انتی بادی که علیه آنها هدایت شده اند مهم می باشند.

انگلهای پروتوزوایی قادر به تحریک پلی کلونال سلولهای B هستند و به این ترتیب در بعضی از عفونتها (مثلا تریپانوزومیازیس ) مقادیر زیا دی از انتی بادی های IgM و IgG غیر ترپانوزومیایی تولید میشود.در چنین مواردی متخصص سنجش ایمنی باید این توانایی را داشته باشد که پاسخ های انتی بادی اختصاصی به انگل را از پاسخ های غیر اختصاصی باز شناسد.انگلهای پروتوزوایی همچنین قادر هستند که پاسخ ایمنی را کاهش دهند (کاهش دهنده ایمنی ) (مثلا بابزیا) و در چنین مواردی سطوح انتی بادی در حال گردش کاهش می یابد .پدیده های ذکر شده در بالا باید هنگام طراحی الایزا برای انگلهای پروتوزوایی به یاد داشته شود.

 

5.5.4

اثر انتی بادی در عفونتهای کرمی

کرمها ( ترماتودها ،سستودها،نماتودها ، اکانتوسفالانها ) بطور طبیعی چرخه زندگی پیچیده ای دارند و اندازه بزرگترآنها و پیچیدگی بیشتر آنها علت افزایش در تنوع انتی ژنی پیدا شده در آنها است . بعلاوه هنگامی که بسیاری از اشکال تکاملی انگل در میزبان وجود دارد ، وجود انتی ژنهای مختص به مرحله ( محدود به هر مرحله ) به اثبات رسیده است .انگل های کرمی عفونتهای مزمن ایجاد میکنند و چنین چالش مواجهه با انتی ژن طولانی مدت میتواند سبب افزایش انتی بادی های در گردش شود. از آنجایی که انگلهای کرمی بطور طبیعی از طریق تماس نزدیک ،ناقلین ،آب ،و احتمالا ذرات منتقل میشوند بافتها و ارگان های متعددی را تحت تاثیر قرار میدهند.بعضی از کرمها یک مرحله مهاجرت کوچکی دارند اما بیشتر آنها قادر به مهاجرت در سرتاسر بافتهای نرم میزبان هستند.

ایزوتایپ های انتی بادی های IgM، IgG،IgA و IgE در پاسخ به انتی ژنهای کرمی تولید میشوند و بستگی به اینکه در کدام محفظه فیزیولوژیکی میزبان جایگزین می شوند هر کدام از این ایزوتایپ ها ممکن است در الایزا برای تشخیص انتی بادی شناسایی کننده انتی ژنهای انگل استفاده شوند. ایمونوگلوبولین های IgE درعفونتهای کرمی سطح افزایش یافته ای دارند و اگر چه تنها بخشی از ایمونوگلوبولین های IgE فعالیت انتی بادی علیه انتی ژنهای انگل را دارند ، این کلاس از ایمونوگلوبولین ها بیشتر در مقاومت به کرمها نقش ایفا میکنند.هر دو انتی بادی IgG و IgE در مکانیسمهای سلول کشی وابسته به انتی بادی علیه انگل های کرمی دخیل هستند.

انگلهای کرمی پیچیده ترین عواملی هستند که پستانداران را عفونی میکنند و به این ترتیب پاسخ انتی بادیهای میزبان به آنها متنوع است.برخلاف دیگر بیماری های عفونی بیشتر کرمها در بدن میزبان نهایی تقسیم نمی شوند و بنابراین بار انتی ژنی ارتباط مستقیم با دوز عفونی دارد.گونه های اکینوکوکوس و گونه ها ی استرونجیلوئیدس استثنا هستند.انتی باد یها علیه انتی ژنهای موجود در کرمها (انتی ژنهای سوماتیک) ، انتی ژنهای روی سطوح بیرونی کرمها (انتی ژنهای سطحی ) و انتی ژنهای دفعی یا ترشحی کرمی ( انتی ژنهای دفعی –ترشحی   (انتی ژنهای ES) ) تولید میشوند.انتی ژنهای دفعی - ترشحی کرمها نشان داده اند که بیشترین اختصاصیت را در سنجش های ایمنی دارند. همه مراحل چرخه زندگی کرم در میزبان رخ نمی دهد و بنابراین حیاتی است که متخصص سنجش ایمنی این موضوع را در مورد پاتوژن مورد نظر در نظر داشته باشد.انتی ژنهای تهیه شده یا استخراج شده از مراحل انگل که در میزبان نهایی حضور نداردغیر محتمل است که کاربردی در تشخیص انتی بادی های ضد انگل در میزبان داشته باشد. چون کرمها درون میزبان تکامل می یابند مراحل اولیه تکامل آنها تولید انتی بادی تنها علیه انتی ژنهای این مراحل را تحریک میکند.مراحل تکاملی بعدی، انتی بادی هایی را تحریک میکنند که نه تنها علیه مراحل مربوطه است بلکه علیه مراحل قبلی، درصورت وجود انتی ژنهای هومولوگ یا دارای واکنش متقاطع نیزاست.پاسخ ایمنی هومورال به کرمها پیچیده است ودر طراحی الایزا برای عفونتهای کرمی باید دقت کرد تا اینکه واکنشهای متقاطع به حداقل برسد.کرمها قادر به تعدیل پاسخ ایمنی هستند و سرکوب پاسخ های ایمنی در بعضی از بیماری ها رخ میدهد (مانند همونکوس ).

 

5.5.6

مروری بر تولید انتی بادی

در مراحل قبلی پیچیدگی پاسخ ایمنی هومورال به عوامل بیماری های عفونی تشریح شد .همانطور که عوامل از نظر ساختاری پیچیده تر می شوند درجات بیشتری از تنوع انتی ژنی ایجاد شده که می تواند تشخیص ایمنی را پیچیده تر کند.با این حال معلوم است که عوامل بیماری های عفونی تولید انتی باد یهای اختصاصی در میزبان ها را تحریک میکنند و این انتی باد یها را میتوان در الایزا برای تشخیص مواجهه میزبان با پاتوژن بکار برد. برهم کنش بین میزبان و پاتوژن سبب ازادسازی انتی ژنهای پاتوژن به داخل مایعات بدن میزبان میشود.ازاین انتی ژنها میتوان در الایای برای تشخیص عفونت جاری استفاده کرد .در نواحی اندمیک پستانداران ممکن است با بیش از یک پاتوژن عفونی شوند.در مواردی که انتی ژنهای هر پاتوژن واکنش متقاطع با انتی بادی های تولید شده در پاسخ به پاتوژنهای دیگر ندارد تشخیص به روش سنجش ایمنی بسیار ساده است.مشکلات وقتی اجتناب ناپذیرمیشود که انتی ژنها و انتی بادی های با واکنش متقاطع وجود دارند( احتمالا ناشی از پاتوژنهای بسیار مرتبط با هم ). هنگام طراحی الایزا برای چنین سیستم هایی باید دقت صورت گیرد و تحقیقات اساسی روی مشکل واکنشهای متقاطع انجام شود.

با درنظر گرفتن انتی ژنهای مفید در تشخیص برمبنای ایمنی مشخص است که هر چه تعداد یا تنوع انتی ژنهای بکار رفته در تشخیص انتی بادی های در گردش بیشتر باشد تنوع انتی بادیهای تشخیص داده شده نیز بیشتر خواهد بود و به این ترتیب احتمال تشخیص موارد مثبت بیشتر میشود.با این حال بخاطر پیچیدگی و واکنش متقاطع انتی ژنها و انتی باد یها متخصص سنجش ایمنی باید انتی ژن یا گروه انتی ژنی را انتخاب کند که تولید انتی بادی را تحریک کرده اما واکنش های متقاطع را تحریک نمیکند.

5.5.7

ارتباط بین انتی ژن و انتی بادی در در شرایط in vivo

ما دیدیم که ورود انتی ژنها به داخل بدن میزبان در نهایت منتهی به تولید انتی بادی های در حال گردش درآنها میگردد . در مورد انتی ژنهای پیچیده (مانند انتی ژنهای عامل بیماری عفونی ) هر انتی ژن می تواند تولید ایزوتایپهای انتی بادی را با افیینیتی های متفاوت تحریک کند و از این انتی بادی ها می توان درالایزا در تشخیص بیماری های عفونی استفاده کرد.در بعضی از بیماری های عفونی (مانند ویروسها ،باکتریها ،پروتوزوا ها) که درآن پاتوژنها در بدن میزبان تقسیم میشوند همانطورکه بار پاتوژنی افزایش می یابد همانطور هم بار انتی ژنی افزایش می یابد.بطور مشابه هنگامی که با پاتوژنها بطور موثر برخورد میشود (مثلا با لیز شدن ) انتی ژنهایی که در داخل قرار گرفته اند ، به داخل بافتهای اطراف آزاد میشوند و بنابراین سبب افزایش بار انتی ژنی ازاد در میزبان میگردند.

یک عملکرد انتی بادیها این است که انتی ژنهای ازاد را پاکسازی کنند و سبب شوند که کمپلکسهای انتی ژن / انتی بادی تولید شده توسط سلولهای فاگوسیت کننده حذف شوند.مهم است که کینتیک ظهور و پاکسازی انتی ژن و انتی بادی را هنگام پاسخ انتی بادی به عوامل بیماری عفونی در نظر داشته باشیم.

در مراحل اولیه یک عفونت انتی باد یهای در گردش خیلی کمی وجود دارند .هنگامی که انتی ژنهای بیماری عفونی توسط میزبان پردازش میشوند ساخت انتی بادی رخ میدهد و این انتی بادی ها غالبا از نوع ایزوتایپ IgM هستند و انتی ژنهای اختصاصی را شناسایی میکنند.در این مرحله از فرایند بیماری انتظار میرود سطح انتی ژن بیشتر از سطح انتی بادی در نمونه های مایع باشد بعبارت دیگر با انتی ژن مازاد روبرو هستیم.چون نسبتا غلظت بیشتری از انتی ژن نسبت به انتی بادی وجود دارد تمام انتی بادیهای موجود به انتی ژن متصل شده و کمپلکسهای ایمنی تشکیل میشود و بقیه انتی ژنها ازاد باقی میمانند و در مایعات بدن گردش میکنند.همینطور که انتی بادی بیشتری در پاسخ به چالش انتی ژنی مداوم تولید میشود غلظتهای نسبی انتی بادی و انتی ژن یکسان میشود واین انتی بادیها به انتی ژنها متصل شده و انتی ژن ازاد کمتری وجود خواهد داشت.در نقطه ای که مقدار انتی بادی در گردش با مقدار انتی ژن ازاد برابر میشود و به دنبال آن برهم کنش انتی ژن / انتی بادی در جهت تولید کمپلکسهای ایمنی رخ میدهد هیچ انتی بادی ازاد و هیچ انتی ژن ازاد باقی نمانده و در این نقطه هر دو واکنشگر برابر خواهند بود.هنگامی که غلظت انتی بادی در گردش از غلظت انتی ژن در گردش تجاوز میکند هیچ انتی ژن ازادی وجود نخواهد داشت اما مقداری انتی بادی آزاد باقی میماند و بعبارت دیگر انتی بادی مازاد خواهیم داشت.

این شکلی ساده شده از برهم کنش بین انتی بادی و انتی ژن است و بیان میکند هر وقت برهم کنشی بین انتی بادی اختصاصی به یک انتی ژن اتفاق میافتد کمپلکس های ایمنی تشکیل میشوند. ایزوتایپ انتی بادی،افینتی انتی بادی،تعداد اپی توپها روی یک مولکول انتی ژن و مزمن بودن تولید انتی ژن و انتی بادی همه در تعیین سرنوشت کمپلکس های ایمنی مهم هستند.بطور کلی کمپلکسهای بزرگ ( کمپلکسهایی که از برهمکنش های انتی بادی ها و انتی ژن با اپی توپهای زیاد ایجاد میشوند)توسط سلولهای فاگوسیت کننده حذف میشوند.کمپلکسهای کوچکتر ( کمپلکس انتی بادی ها و انتی ژن با اپی توپهای کمتر) به آهستگی توسط فاگوسیتها حذف میشوند و در گردش بیشتر باقی میمانند.مکانهای اصلی برای برداشت کمپلکسهای ایمنی ، کبد ( سلولهای کوپفر ) ، طحال و ریه ها هستند.کمپلکسهای ایمنی با افینتی پایین از کمپلکسهای با افینتی بالا کوچکتر هستند وبنابراین بیشتر در گردش باقی میمانند.کمپلکسهای انتی ژن مازاد و انتی بادی مازاد بطور طبیعی کوچکتر از کمپلکسهای ایمنی انتی ژن /انتی بادی هم ارز هستند و بنابراین در گردش بیشتر باقی می مانند.

بعضی از اسیب زایی همراه با بیماری های عفونی بخاطر رسوب کمپلکس ایمنی است .بنابراین در موارد معینی غلظت کمپلکسهای ایمنی محلول ( در حال گردش ) در مایعات بدن میتواند اطلاعاتی  در رابطه با اسیب شناسی کمپلکس ایمنی فراهم کند.متخصص سنجش ایمنی باید قادر باشد برای کمپلکسهای ایمنی محلول سنجش هایی را طراحی کند.برای مثال در کمپلکسهای انتی ژن مازاد که انتی بادی اختصاصی به انتی ژن ( ترجیحا از گونه های غیر از میزبان ) وجود دارد انتی ژن را می توان با انتی بادی جذب شده روی پلیت الایزا به دام انداخت.واکنش با یک کنژوگه انزیم انتی بادی اختصاصی ضد گونه میزبان قابل طراحی است.

ازآنجایی که بیماری های عفونی اغلب مزمن هستند کمپلکس های ایمنی بخاطر انتی ژن مداوم وساخت انتی بادی تشکیل میشوند.در مراحل اولیه ،انتی ژن مازاد وجود دارد و به این ترتیب متخصص سنجش ایمنی میتواند انتی ژن در گردش را اندازه بگیرد.به یاد داشته باشید که انتی ژن انتخاب شده برای سنجش، لازم است برای پاتوژن مورد نظر اختصاصی باشد.همانطورکه وضعیت بیماری به سمت مزمن شدن پیشرفت میکند به دلیل تولید افزایش یافته انتی بادی انتی ژن آزاد کمتری در دسترس خواهد بود و متخصص سنجش ایمنی باید انتی باد یهای در گردش یا کمپلکس های ایمنی در گردش را بسنجد.باید در ذهن داشته باشید که ارگانیزمهای بیماری های عفونی از نظر انتی ژنی پیچیده هستند ، ممکن است درون میزبان تقسیم بشوند یا نشوند ، ممکن است میزبان را دوباره عفونی کنند یا ممکن است از نظر انتی ژنی تفاوت داشته باشند و به این ترتیب موارد توصیف شده در رابطه با  انتی ژن وانتی بادی از پاتوژن تا پاتوژنی دیگر تفاوت خواهد داشت. ازآنجایی که پاتوژنها انتی ژنهای متعدد با ایمونوژنیسیتی متفاوت تولید میکنند بسیاری از برهمکنش های انتی ژن / انتی بادی شامل انتی بادیهای با افینتی پایین و بالا خواهد بود.

 

 مفیدترین سنجش ها آنهایی هستند که ملاحظات قبلی در آنها به حساب آمده است.برهم کنشهای پاتوژن /میزبان قبل ار اینکه الایزا طراحی شود بطور کامل بررسی شود.دراخر اینکه ،بسیاری از عوامل بیماری های عفونی اثرات تعدیل کننده ایمنی دارند شامل سرکوب ایمنی که کاهش تولید انتی بادی هومورال از آن جمله است تا القای تحمل سلول B یا T را شامل می شود.تحمل سبب میشود یک ارگانیزم  به یک انتی ژن خاص غیر پاسخ دهنده شود که ممکن است به شیوه های مختلفی رخ دهد اما برون ده آن است که انتی بادی ها تولید نمیشوند. عوامل بیماری های عفونی می توانند گیرنده های سلولهای سازنده انتی بادی یا لنفوسیتهای اختصاصی به انتی ژن را مسدود کرده و آنها را غیر پاسخ دهنده به انتی ژن سازند.وقتی سطوح بالای انتی ژنی مانند پلی ساکارید پنوموکوکی رخدادی را القا میکنند وضعیتی با میزان تحمل بالا به وجود می آید. و هنگامی که دوزهای پایینی از انتی ژن منومری سبب رخدادی میشوند وضعیتی با تحمل پایین به وجود می آید.بنابراین در طراحی الایزا اثر انتی ژنهای انگل روی القای تحمل باید در نظر گرفته شود.

 

5.8

کاربرد تشخیصی انتی ژنها و انتی بادی ها در بیماری های عفونی

تشخیص انتی ژنها و انتی بادی های اختصاصی می تواند در تشخیص ازمایشگاهی بیماری های عفونی مفید باشند.همانطور که ما دیدیم تولید انتی باد یهای اختصاصی در پاسخ به چالش انتی ژنی وابسته به چندین عامل است.نه تنها انتی ژنها و انتی بادی ها بلکه کمپلکسهای ایمنی می توانند در الایزا تشخیص داده شوند و هرکدام به تشخیص بیماری کمک کنند.بطور کلی انتی ژنهای در گردش آزاد نسبت به انتی بادی های در گردش ازاد مدت زمان کوتاهی حضور دارند.عفونت مجدد با همان پاتوژن یا شدیدتر شدن بیماری سبب افزایش گذرا در انتی ژن آزاد در گردش (انتی ژنمی) می شود و به دنبال آن تولید انتی بادی ها افزایش خواهد داشت.هر دوی این رخدادها را با الایزا میتوان تشیخص داد و متخصص سنجش ایمنی باید ازاین مورد اگاه باشد.بطور مشابه کمپلکس های ایمنی محلول را نیز میتوان با الایزا تشخیص داد اگر چه طراحی سنجش تا حدی پیچیده تر است .

از آنجایی که عوامل بیماری عفونی تولید انتی بادی های اختصاصی را تحریک میکنند از این انتی بادی ها میتوان در تشخیص عفونت استفاده کرد.بطور طبیعی پاسخ انتی بادی دوامدار است واغلب در غیاب انتی ژنهای وارد شونده وجود دارند.به همین دلیل تشخیص این انتی باد یها در میزبان وجود عفونت جاری را مشخص نمی کند اما نشاندهنده مواجهه است .انتی بادی های ضد بعضی انتی ژنها با دوام تر از انتی بادی ضد دیگر انتی ژنها هستند و در بعضی از موارد ممکن است تمام طول عمر فرد دوام داشته باشند.در چنین مواردی مساله این است که آیا میزبان ایمن بوده یا غیر پاسخگو به عفونت مجدد است ؟ با تشخیص انتی باد یهای ضد موزاییک انتی ژنی پاتوژنها نمی توان پاسخ داد.سوالهایی مانند ،ایا انتی بادی باقی مانده در جلوگیری از عفونت مجدد موثر است ؟ تنها وقتی می تواند پاسخ داده شود که اثرات بیولوژیکی این انتی بادی ها معلوم باشد.

 

اثراتی مانند خنثی سازی ،اگلوتیناسیون ،چسبیدن به گیرنده ها برای جلوگیری از جایگیری و لیز، اثرات بیولوژیکی کاملا شناخته شده انتی باد یها روی عوامل بیماری عفونی هستند.اگر مکانیسم ایمنی معلوم باشد (یعنی اثر انتی بادی روی انتی ژنهای هدف ) و اگر انتی ژنهای هدف را بتوان جدا کرد می توان از آنها در الایزا برای ردگیری میزان تولید و دوام انتی بادی محافظت کننده استفاده کرد.تعداد کمی از این سنجش ها در حال حاضر موجود است و بنابراین متخصص سنجش ایمنی باید پدیده های عمومی دیگر همراه در پاسخ ایمنی را بکار گیرد.وضعیتهای ذیل بسطی در این نظریه هستند .

 

5.8.1

نوزادان

انتی بادی مادری ایزوتایپ IgG بطور غیر فعال از طریق جفت و از طریق آغوز به نوزادان منتقل میشود .ایزوتایپ های دیگر(IgA،IgM) نیز در آغوز و شیر یافت میشوند اما از طریق دستگاه معدی روده ای نوزادان عبور نمیکنند.هر دو انتی بادی IgM و IgG را میتوان ضد انتی ژن خاصی مورد سنجش قرار داد ، و هنگامی که انتی بادی های IgG در غیاب انتی بادی IgM وجود داشته باشند احتمال اینکه بطور غیر فعال منتقل شده باشند بالا است.وقتی انتی باد یها ی IgM هومورال وجود داشته باشد پس ارگانیزم باید آنها را به طریق درونزاد ساخته باشد.اگر انتی بادی های دیگر محفظه های فیزیولوژیکی بدن سنجش میشوند (مثلا دستگاه معدی روده ای ) آنگاه این نتایج بی ارزش است چون هر دوی IgA و IgM در شیر ترشح میشوند و ممکن است هنوز از نظر بیولوژیکی به عنوان پیش آنتی بادی (pro antibody) فعال باشند.

5.8.2

پستانداران متعهد از نظر ایمونولوژیکی

ما دیدیم که IgM اولین ایزوتایپ انتی بادی هومورال تولید شده در پاسخ به چالش انتی ژنی است و اینکه اگرچالش دوام یاید، ایزوتایپ IgG جایگزین میشود.اگر عفونت مزمن شود و حضور انتی ژن دوام دار باشد یا مواجهه دوباره رخ دهد مقادیر بالاتری از IgG تولید خواهد شد.این اطلاعات برای متخصص سنجش ایمنی با ارزش است چون وقتی کل انتی بادیها (تمام ایزوتایپ ها ) سنجش میشوند افزایش در تیتر انتی بادی در گذر زمان نشان دهنده عفونت جاری است .این مساله نیز وقتی انتی سرم ثانویه اختصاصی به ایزوتایپ استفاده میشود درست است .مقایسه سطوح IgM و IgG نیز یک شاخص کاربردی است .

انتی ژنهای مقاوم یک سویچ ایزوتایپی را در انتی ژنهای وابسته به سلول T القا میکنند و تولید IgG را بجای IgM تحریک میکنند.اگر سطوح IgM و IgG ضد انتی ژن یکسان مقایسه شوند این نتایج استنباط میشود : انتی بادی IgM درغیاب انتی بادی IgG به این معنا است که عفونت به تازگی رخ داده ، چون هیچ سویچ ایزوتایپی تا کنون رخ نداده است .وجود انتی بادی IgM و IgG به این معنا است که عفونت قبلی وجود دارد چون سویچ ایزوتایپی رخ داده و پاسخ موجود IgM احتمالا رو به کاهش است. عفونت قبلی طوری که سویچ ایزوتایپی رخ داده باشد به این معنا است که میزبان در معرض دوباره همان انتی ژن قرار گرفته و تولید انتی بادی IgM بیشتری را تحریک کرده است.

انتی بادی IgG در غیاب انتی بادی IgM به این معنا است که عفونت قبلی و سویچ ایزوتایپی رخ داده است و پاسخ IgM نیز پایین تر از حد سنجش است .در این مورد عفونت ، مزمن در نظر گرفته میشود.

وقتی انتی ژنها در دستگاه تنفس یا دستگاه معدی روده ای یا دستگاه ادراری تناسلی لوکالیزه میشوند تولید انتی بادی های محلی را تحریک میکنند و تشخیص ایزوتایپ انتی بادی IgA دارای ارزش خواهد بود.بطور مشابه وقتی معلوم است که بعضی پاتوژنها پاسخ های ویژه ایزوتایپی (مانند کرمها) را تحریک میکنند،آنگاه پاسخ های انتی بادی خاص IgE سنجش میشوند.

 

5.8.3

Herd immunity

هر فردی در یک گروه پتانسل متغیری در پاسخ دهی به انتی ژنها دارد و به این ترتیب پاسخ ایمنی محافظت کننده ایجاد میشود .محدوده پاسخ ایمنی در یک گروه از یک الگوی توزیع نرمال تبعیت میکند طوری که بیشتر افراد پاسخ ایمنی متوسطی را ایجاد میکنند و نسبت کوچکی هم هستند که  یا پاسخ ایمنی خیلی موثر و یا یک پاسخ ایمنی غیر موثر ایجاد میکنند.هنگام واکسیناسیون یا مواجهه با یک پاتوژن کمتر از 100% جمعیت به میزان کافی محافظت می شوند و برای آن افرادی که نگرانی موجود است این نبود محافظت جدی است .این فقدان حفاظت ممکن است بخاطر عدم توانایی در شناخت انتی ژنها یا درتولید انتی بادی ها (اگاما گلوبولینمیا)باشد . این افراد می توانند در آینده به عنوان مخزن پاتوژنها برای انتقال به دیگر افراد حساس عمل کنند و شدید بودن وضعیت به شیوه انتقال ، تعداد افراد حساس بستگی داشته و در موارد واکسیناسیون بر تاثیر واکسیناسیون اثر میگذارند .

 

کمتر از 100% حفاظت ممکن است برای پیشگیری از شیوع بیماری در بین جمعیت کافی باشد چون احتمال مواجه شدن افراد حساس با افراد عفونی کاهش یافته است.این پدیده به عنوان ایمنی جمعیتی (herd immunity) خوانده میشود و موضوع مهمی در ارزیابی توان افراد یک جمعیت برای ابتلا به عفونت است.

عوامل بسیاری می توانند کمیت و کیفیت یک پاسخ ایمنی را تحت تاثیر قرار دهند بیشتر آنها قبلا گفته شده اند .دیگر عوامل که پاسخ ایمنی را تحت تاثیر قرار میدهند شامل استرس ،حاملگی ،جراحی ،عفونتهای همزمان ،دمای بیش از حد و بخصوص تغذیه بد میباشد .تمام این عوامل میزان وکیفیت پاسخ ایمنی را کاهش میدهند و هنگامی که  متخصص سنجش ایمنی بررسی سرواپیدیمیولوژیکی را برای ایمنی جمعیتی بین جمعیت های مختلف انجام میدهد، قبل از تعیین سطح کافی بودن  حفاظت در یک جمعیت این عوامل باید بحساب ایند.

برای هر بیماری عفونی سطح انتی بادی (اگر وجود داشته باشد)در افراد مواجه نشده ،عفونی شده بصورت تحت بالینی ، عفونی شده بصورت بالینی ، و افراد دارای ایمنی در جمعیت اندمیک باید مشخص شود.تنها به این شیوه متخصص سنجش ایمنی میتواند سطح انتی بادی را به عفونت ربط دهد.وقتی این پارامترها مشخص شدند آنگاه اثر واکسیناسیون دراین افراد و نیز ارتباط بین انتی بادی محافظت کننده و ایمنی قابل سنجش است.

یک مشکل عمده در افراد ساکن نواحی اندمیک است که مواجهه قیلی با یک عامل بیماری عفونی یا انتی ژنهایی از این دست داشته اند، بنابراین نسبت دادن یک تیتر انتی بادی یا حد استانه ای که بالاتر از آن حفاظت رخ میدهد و کمتر از آن عفونت مجدد ، اگر ممکن نباشد ،ولی سخت خواهد بود.هنگام ارزیابی اثرات حفاظتی واکسیناسیون در چنین گروههایی این وضعیت پیچیده تر می شود.اغلب سطح انتی بادی افراد بخاطرمواجهه مزمن ایستا وبخاطر عوامل مذکور در قبل متغیراست.در مواردی که افراد برخورد نکرده ایمن میشوند تبدیل سرولوژیکی رخ میدهد اما در بیشتر مواردی که افراد مواجهه قبلی داشته اند افزایش در سطح انتی بادی باید در نظر گرفته شود.این موارد ممکن است چنان کوچک باشد که از نظر اماری غیر قابل ملاحظه باشد.

 

5.9

معمول بودن انتی ژنی

از آنجایی که تعداد محدودی امینواسید و کربوهیدرات وغیره تولید شده توسط موجود زنده تولید میشود بنابراین تعداد ترکیبات از این اجزا هم محدود است ( برای کربوهیدارت ها و پروتیین ها ).بنابراین احتمال دارد که موجودات مختلف پروتیین ها و گلیکوپروتیین های شبیه به هم را تولید کنند.وقتی که شباهت جزیی یا کامل در محصولات موجودات زنده رخ دهد اشتراک در شناسایی توسط انتی بادیها اتفاق میافتد.

به نظر میرسد پروتیین های ساختاری کاملا حفظ شده باشند و انتظار می رود که واکنش متقاطع ایمونولوژیک نشان بدهند .ماهیت این واکنش متقاطع بین مولکولهای انتی ژنی مشابه فرق میکند و بستگی به توانایی جور شدن پاراتوپ به اپی توپ دارد.

ما دیدیم که پاراتوپ انتی بادی ها به اپی توپ هایی که آنرا بطور جزیی یا کامل شناخته اند متصل خواهند شد .متخصص سنجش ایمنی باید درنظر داشته باشد که انتی ژن مد نظر یا انتی ژنهای مشابه احتمالا در تعدادی عوامل عفونی وجود خواهد داشت.برای مثال بسیاری از انتی ژنهای سطحی در ماهیت کربوهیدرات هستند و همان اپی توپها ممکن است روی دو نوع سلول وجود داشته باشند یکی از آنها ممکن است پاتوژن و دیگری ممکن است همزیست باشد.بطوری مشابه بعضی از کربوهیدرات ها ممکن است در عوامل بیماری عفونی مختلف بطور گسترده وجود داشته باشد.(مانند امثال گروه خونی ،اسکارون).وقتی انتی بادی های پلی کلونال در پاسخ به عفونت تولید میشوند انتی بادی های ضد اپی توپهای غیر متقاطع علاوه بر اپی توپهای متقاطع تولید خواهند شد و به این ترتیب مشکل واکنش متقاطع به حداقل می رسد.

مشکل اشتراک انتی ژنی وقتی روشن تر میشود که انتی بادی های منوکلونال در تشخیص استفاده شود .در مرحله طراحی یک سنجش متخصص سنجش ایمنی باید در نظر داشته باشد که دیگر انتی ژنها شامل انتی ژنهای دیگر عوامل عفونی ممکن است در واکنشهای متقاطع شرکت کنند و هنگام طراحی سنجش نوع مشکلی که همراه با این واکنشهای متقاطع پیش میاید باید در نظر گرفته شود.

 

1. تکنیک های دیگر

کارایی یک ایمونواسی خوب همچنین نیاز به یک مهارت عملی در تکنیکهای ایمونوشیمی ( و یا حداقل نیاز به دانش چنین تکنیکهایی هنگام استفاده) دارد.فهرست زیر بعضی از تکنیکهایی مورد استفاده در تخلیص و تعیین ویژگی های انتی ژنها و انتی بادی ها را ارایه میکند.

1. سانتریفیوژ با شیب غلظتی سوکروز
2. الکتروفورز با ژل پلی اکریل امید(PAGE)
3. PAGE و به دنبال آن ایمونوبلاتینگ
4. ایزوالکتریک فوکوزینگ
5. ایمونودیفیوژن در آگار/ آگاروز
6. ژل کروماتوگرافی (DEAE, Affinity,sephadex)
7. بخش کردن IgG با نمک
8. روشهای کنژوگاسیون آنزیم

ماهیت و فراورده بخش انتی بادی و ارتباط آن در بیماری و در سنجش باید بررسی شود ( یعنی بخش مورد نظر چیست آیا کل مولکول ، Fc ،Fab ،F[ab]2 ، IgM یا IgA است).

 

2. واحدها

سنجش های موفق وابسته به دانش واحدهای حجم و وزن است .مفهوم صحت در رقتها و ارتباط روشهای پی پت کردن نیز در موضوع مهارتهای لازم برای سنجش ها قرار میگیرد.

حجم ها

پی پتهای مورد استفاده در سنجشهای میکروتیتر به صورت میکرولیتر درجه بندی شده اند .ارتباط حجم ها در جدول 2 آمده است .

وزنها

به ارتباط وزنها که در جدول 3 آمده است دقت کنید.

 

1. رقتها

مشکلات اغلب در ساخت رقتها رخ میدهد.لازم است که در ساخت رقتهای درست دقت شود و هدر رفت ریاجنتهای گران از طریق ساخت رقتهای معمول اتفاق نیفتد.برای مثال ما نیاز داریم یک رقت 1/1200 از یک نمونه ای که رقت 1/50 دارد در یک حجم نهایی 5.5 ml بسازیم.اغلب کاربران سعی میکنند که حجم ها را گرد کنند و بنابراین حجم هایی بیشتر از آنجه که نیاز است ساخته میشود و سبب هدر رفت ریاجنتها میشود( مثلا کنژوگه ها ).

مشکلات دیگر در ساخت مثلا یک رقت 1/20000 در یک حجم کوچک مانند 3 ml نیز پیش میاید.

تمام مشکلات به شرطی آسان میشود که تمام حجم ها در محاسبه ها به میکرولیتر تبدیل شوند.مثالهای زیر این موضوع را بهتر بیان میکند.

1. 1. ساخت یک رقت 1/100 از یک نمونه دست نخورده در یک حجم نهایی 10ml

نمونه دست نخورده به این معنی است که رقیق نشده است .بنابراین ما یک حجم نهایی 10ml نیاز داریم . حجم مورد نیاز را به میکرولیتر تبدیل کنید.

10 * 1000 ul = 10000 ul

رقت مورد نیاز 1/100 است. حجم نهایی را به این نسبت تقسیم کنید.

10000 / 100 = 100

این حجمی از نمونه دست نخورده یعنی رقیق نشده است که باید به حجم نهایی برحسب میکرولیتر اضافه شود. که بنابراین برابر است با 100 ul .

در این مثال مشکل کمی در استفاده از میکرولیتر وجود داشت.بنابراین 10 ml / 100 = 0.1 ml  . پس بنابراین ما باید 100 ul از نمونه رقیق نشده را به 9900 ul (9.9 ml) از رقیق کننده (حجم نهایی منهای حجم اضافه شده از نمونه دست نخورده) اضافه کنیم.تبدیل 0.1 ml  به واحد حجم میکروپی پتها بنابراین باید انجام شود یعنی  0.1 ml = 100 ul .

یک مثال محاسبه ای تقریبا پیچیده مزیتهای تبدیل ابتدایی تمام حجم ها را به میکرولیتر نشان میدهد.

1. 1. 1. . ساخت رقت 1/200 از یک نمونه دست نخورده در حجم نهایی 4 ml .

حجم لازم را به میکرولیتر تبدیل کنید 4 ml = 4000 ul . فاکتور رقت بنابراین 200 است.بنابراین ما 4000 / 200 = 20ul از نمونه دست نخورده نیاز داریم .( درچنین محاسبه هایی بررسی دوباره باید انجام شود).بنابراین ، فاکتور رقت ضربدر حجم نمونه ای که باید رقیق شود که برابر میشود با حجم مورد نیاز. توجه کنید که در استفاده از میلی لیتر خواهیم داشت  4 / 200 = 0.02 ml . این مورد کمی تنظیم کردن میکروپیپت را مشکل میکند.

1. 1. . محاسبه نمونه رقیق شده

نمونه ای رقیق شده داریم و می خواهیم در محاسبه رقتها وارد کنیم.یک نمونه رقیق شده با رقت 1/50 داریم . ما یک رقت 1/1000 در حجم نهایی 20 ml نیاز داریم.

این نوع از محاسبه ها بیشترین مشکلات را ایجاد میکنند.حجم مورد نیاز را به میکرولیتر تبدیل نمایید.حجم نهایی مورد نیاز 20 ml = 20000 ul است .فاکتور رقت مورد نیاز 1000  است.

اکنون فرض کنید که نمونه رقیق نشده است.بنابراین ما 20000/1000 = 20ul از نمونه رقیق نشده نیاز داریم.بنابراین از آنجایی که نمونه 1/50 رقیق شده است ما مجبوریم بیشتر اضافه کنیم.فاکتور مورد نظر با فاکتور رقت معلوم (50) تعیین میشود.بنابراین ما مقداربرای نمونه رقیق نشده را در این فاکتور ضرب میکنیم.

20ul * 50 = 1000 ul

این محاسبه ممکن است روشن به نظر برسد اما رقت سازی پیچیده ای انجام شده است.

 

1. 2. . رقیق سازی حجم نهایی

ما یک رقت 1/18000 در حجم نهایی 27 ml نیاز داریم.در حال حاضر ما یک رقت 1/25 از نمونه در اختیار داریم.با تبدیل به میکرولیتر حجم نهایی لازم 27000 ul خواهد بود.فرض کنید که نمونه رقیق نشده است پس ما 27000/18000=1.5 ul نیاز داریم.از آنجایی که نمونه رقیق شده است پس 1.5 ul را در فاکتور رقت ضرب کنید.

1.5 * 25 = 37.5 ul

بررسی دوباره : 18000 * 37.5/25 = 27000 ul .هنگامی که رقتهای بسیار بالا در حجم های کوچک نیاز است لازم است که یک سریال محدودی از رقتها انجام دهید تا از هدررفت ریاجنتها جلوگیری کنید.

 

8.5

نیاز به رقتهای بالا

اضافه کردن مستقیم نمونه رقیق نشده نیازمند پی پت کردن 5000/100000=0.05ul میباشد .پی پت کردن این حجم غیر ممکن است. در بیشتر موارد عملی پی پت کردن حجم های کمتر از 5 میکرولیتر توصیه نمی شود . رقتهای بالا که مطرح شد به دو شیوه قابل دستیابی است .گزینه هایی موجود است و به موجودیت ریاجنتی که قرار است رقیق شود بستگی دارد. اگر حجم کمی از نمونه رقیق شونده وجود داشته باشد آنگاه حجم ابتدایی که اولین رقت با آن ایجاد میشود کوچک خواهد بود.بنابراین یک رقت 100/1 در 1000 میکرولیتر را میتوان با اضافه کردن 10 میکرولیتر از نمونه دست نخورده به 990 ul از رقیق کننده ساخت .محاسبه مقداری از این رقت 100/1 که در یک حجم نهایی 5 ml قرار است رقیق شود پس خواهیم داشت 5000/100000*100=5 ul ( ضریب رقتی که هم اکنون ایجاد شد ) .بنابراین با اضافه کردن یک رقت ابتدایی به 1 میلی لیتر از بافر ما میتوانیم رقتهای بالا را با استفاده از حجم های قابل قبول پی پت ایجاد کنیم.

8.6

مرور شیوه های رقت سازی

1. حجم نهایی مورد نیاز را تعیین و آن را به میکرولیتر تبدیل نمایید.
2. این را به ضریب رقت تقسیم کنید.این حجم از نمونه است که باید به حجم نهایی از رقیق کننده بر حسب میکرولیتر اضافه گردد.
3. هنگامی که پیش رقتی از نمونه وجود داشته باشد مراحل 1 و 2 را دنبال کنید آنگاه ضریب پیش رقت را به حجم تعیین شده در مرحله 2 ضرب نمایید.
4. وقتی که رقتهای بالایی مورد نیاز است دو یا سه رقت از نمونه را در حجم های کوچک بسازید.

 

8.7

جبران حجم ها

از آنجایی که ما به یک حجم نهایی نیاز داریم ( در مرحله 1 از زیرعنوان 8.6 محاسبه شد ) پس اضافه کردن نمونه بوضوح حجم نهایی را افزایش خواهد داد.به عنوان مثال ما به یک رقت 10/1 از نمونه در حجم 1 میلی لیتر نیاز داریم.این به این معنی است که ما باید 100 ul به حجم نهایی 1 ml اضافه کنیم.با انجام روش های زیر عنوان 8.1 تا 8.6 ما در انتها یک حجم 1100 ulخواهیم داشت.بنابراین ما به یک رقت صحیح 10/1 نرسیدیم بلکه به 11/1 رسیده ایم.برای رسیدن به نسبت درست این حجم نمونه اضافه شده را میتوانیم از حجم نهایی حذف کنیم .بنابراین درهمین مثال حجم نهایی لازم 1000 ul  است و حجم نمونه محاسبه شده 100 ul است .بنابراین لازم است 100 ul از رقیق کننده را بخاطراضافه شدن 100 ul از نمونه حذف کنیم بنابراین ما 100 ulاز نمونه را با900 ul از رقیق کننده ،رقیق میکنیم تا به 10/1 درست برسیم.

صحت رقت بستگی به حذف معادل حجم نمونه از حجم نهایی دارد.با این حال این هم بستگی به حجم درستی است که قرار است اضافه شود.به عنوان مثال ما به یک رقت نهایی 100 /1 در حجم 1 ml  نیاز داریم.بنابراین ما به حجم نهایی 1000 ul و اضافه کردن 10 ul  از نمونه نیاز داریم .در اینجا ما می توانیم با برداشت 10 ul از رقیق کننده قبل از اضافه کردن 10 ul  از نمونه جبران را انجام دهیم اما  از نظرصحت می بینیم که اختلاف بین رقت ها با و بدون جبران بسیار کم است.به این ترتیب با جبران ما یک رقت 10/1000=1/100  داریم و بدون جبران ما یک رقت 10/1010=1/101  داریم . در عمل تاثیر چندانی ندارد.

 

8.7.1

چه زمان جبران را باید انجام داد

دقیقا قاعده دقیقی در مورد زمان جبران وجود ندارد چون مواقعی وجود دارد که درآن فعالیت یک نمونه با اختلاف بسیار کوچک در رقت تحت تاثیر قرار میگیرد.با این حال معمولا در الایزا صدق نمیکند و به عنوان یک راهنما من پیشنهاد میکنم که هنگامی که حجم نمونه ای که قرار است اضافه شود بیش از 2%< شود جبران همیشه باید انجام شود.بنابراین برای ساختن یک رقت 1/200 ، 5ul را می توان به 1000 ul اضافه کرد (0.5%) : 10 ul را میتوان به 1000 ul (1%)  اضافه کرد: 20 ul را میتوان به 1000ul  ( 2%) اضافه کرد: ولی 40 ul  را باید به 960 ul  اضافه کرد.

 

9

پی پت ها

همانند تمام سنجش ها پی پت کردن صحیح برای بدست اوردن نتایج پایدار بسیار مهم است.پی پت چند کاناله را مورد بررسی قرار دهید.میتواند دارای حجم ثابت ( توزیع یک حجم خاص ثابت ) یا حجم متغیر باشد.در مورد پی پتهای با حجم متغیر حجم تخلیه شده را میتوانید با چرخاندن پیچ که در بالای پی پت قرار گرفته تغییردهید و درجه حجم را در کنار پی پت ببینید.اینها پی پتهای دیجیتال هستند : حجم بصورت یک رقم در کنار پی پت بصورت میکرولیتر نشان داده میشود.

تنظیم حجم های مختلف را تمرین کنید.توجه داشته باشید که کاما(نشاندهنده اعشار) در کجا واقع شده است . بنابراین 200=200ul  و 20.0= 20 ul .

بعضی از پی پتها با استفاده از درجه بندی کوچکتر تغییر میکند.از دستورالعمل های تهیه شده توسط تولید کننده را پیروی کنید.بطور کلی این ها توصیه نمی شوند چون به اسانی اشتباه صورت میگیرد و درجه بندی میل به تغییر میکند.پی پتهای چند کاناله برای تخلیه 4،8 و 12 حجم بطور همزمان طراحی شده اند و بنابراین برای پلیتهای میکروتیتر ایده ال هستند .پی پتهای با 12 کانال بالاترین انعطاف پذیری را نشان میدهند چرا که تا 12 کانال را میتوان استفاده کرد.هر تعداد از کانالها را میتوان با یک نوک بارگذاری کرد ( نهایتا تا 12) . اغلب کاربران وقتیکه برای اولین بار با چنین پی پتهایی مواجه میشوند سردرگم میشوند. پی پت کردن و قرار دادن نوک را تمرین کنید.

 

9.1

عمل پی پت کردن

همیشه به خاطر داشته باشید پی پتی را استفاده کنید که حجم بیشینه آن نزدیک به حجم مورد نیاز شما باشد.تمام پی پتها باید طبق معمول کالیبر شوند ( هر ماه یکبار).روشهای انجام کالیبراسیون را میتوانید از شرکتهای تجاری تامین کننده این پی پتها بدست اورید.بعضی از شرکت ها خدمات کالیبراسیون را ارایه میدهند.نوک پی پتهای خاص کالیبراسیون با حجم های دقیق درج شده روی سطح بیرونی آنها بررسی معمول حجم توزیعی را آسان میکند.پی پتها از نظر آسیب دیدگی نیز باید بررسی شوند.

 

9.1.1

برداشتن محلولها

دکمه بالای پی پت را تا اولین توقف ،قبل از اینکه نوک را در محلول قرار دهید بفشارید وآنگاه نوک را در محلول فروببرید .دکمه را یکنواخت رها کنید.متوجه خواهید شد که یک حجم از مایع به داخل نوک کشیده میشود.بررسی کنید که هر نوک حجم یکسانی دارد.اگر چنین نبود بعد از متوجه شدن اینکه کدام نوک حجم پایینی دارد آن را دور بیندازید.پی پت کردن را دوباره تکرار کنید.

 

9.1.2

توزیع محلولها

اگر امکان دارد انتهای نوک ها را در چاهکها طوری که روی جدار پلاستیک تکیه دارد قرار دهید . دکمه پی پت را تا توقف اول بفشارید.محلول ها تخلیه میشوند تلاش کنید که نوک ها را از کنار جداره چاهک ها عقب بکشید.وقتی کارتان به اتمام رسید یا نوک ها را با دست یا با فشار دادن پرت کننده نوک که در کنار پی پت تعبیه شده نوک ها را خارج کنید این کار در مورد بعضی از نوک ها عمل میکند و نه همه آنها .

9.1.3

پی پتهای تک کاناله

پی پتهای تک کاناله برای تخلیه حجم های منفرد از محلول ها به ویژه برای حجم های کوچک استفاده میشوند.این ها  می توانند ازانواع درجات کوچک یا دیجیتال باشند ، ثابت یا متغیر باشند.

9.1.4

مخازن

مخزن ها برای توزیع مایع توسط پی پتهای چند کاناله درالایزا عمل میکنند.این ها میتوانند ساخت داخل یا تجاری باشند و یا یک یا چند مخزن باشند . بعضی از آنها تنها مناسب برای هشت کانال هستند.

9.2

تمرین پی پت کردن

برای کار با پی پتها تمرین های ساده ای را در ساخت سری رقت در پلیتهای میکروتیتر تمرین کنید.مواد زیر لازم است .

1.پی پت چند کاناله

2. مخزن

3. نوکها

4.محلول رنگ ( مانند فنل رد در آب ،تریپان بلو)

5. آب

ساخت سری رقت در سنجش ایمنی بسیار مهم است.در بیشتر موارد چندین سری رقت با استفاده از پی پتهای چند کاناله انجام می شود.. یک سری رقت در ادامه آمده است.

برای یک سری رقت دوبرابری در یک حجم 50 ul ، 50 ul از ماده ای که قرار است رقیق شود را به 50 ul از رقیق کننده بیفزایید، مخلوط کنید ، 50 ul از این رقت را به 50 ul از رقیق کننده دیگر منتقل کنید و تکرار کنید تا به طیف رقت برسید.

در پلیت های میکروتیتر حجم مورد نیاز از رقیق کننده را در چاهکها با پی پتهای چند کاناله توزیع نمایید.ماده ای که قرار است تیتر شود یا با رقت اولیه ( در حجم مورد ازمایش ) به چاهک اول اضافه میشود و در دومین چاهک در حجم مساوی از رقت اولیه و همان حجم از رقیق کننده و یا اینکه در ردیف اول تنها با نمونه ای دوبرابر غلظت اولیه مورد نیاز در یک حجم ازمایش از رقیق کننده اضافه میشود.محلول در ردیف اول و دوم آنگاه با استفاده از پی پت چندکاناله مخلوط میگردند و حجم مورد ازمایش به چاهک بعدی که حاوی حجم مورد ازمایش از رقیق کننده است منتقل میشود ، این کار را با استفاده از پی پت چند کاناله انجام دهید.

 

این فرایند در تمام چاهک ها تکرار میشود که هر کدام حاوی حجم مورد ازمایش از رقیق کننده است .در بیشتر موارد اثرات ریاجنت باقی مانده را وقتی از همان نوک ها برای سری رقت استفاده میشود میتوان در نظر نگرفت. بنابراین هر تعداد از سری های رقت حداکثر تا 12 ردیف ( 8 رقت ) یا هشت ردیف ( 12 رقت ) به راحتی تهیه میشود . برای تمرین مراحل در ذیل امده است .

1. 50ul از رقیق کننده (آب) را به هر چاهک از یک پلیت اضافه کنید.
2. 50ul از محلول رنگی به ردیف اول (A-H) از پلیت با استفاده از پی پت چند کاناله اضافه کنید.
3. با عمل پی پت کردن مخلوط کنید
4. 50 ul از رنگ رقیق شده را از ردیف 2 به 3 منتقل کنید و مخلوط کنید
5. 50 ul از ردیف 3 به 4 منتقل کنید و مخلوط کنید
6. تا ردیف 12 تکرار کنید.

 

ما اکنون 8 ردیف (A-H) با طیف رقت یکسان از رنگ را داریم.این یک طیف دو برابری ( حجم های مساوی منتقل شده اند) از 1/2 ، 1/4 ، 1/8  ، و به همین ترتیب تا 1/4096 است .شما می توانید هر طیف رقت با هر ضریبی داشته باشید بستگی به حجمی که منتقل میکنید.

طیف رقت را مورد بررسی قرار دهید و مطمین شوید که ردیف ها حجم های یکسانی داشته باشند و اینکه اثر رقت منطقی بین ردیف ها وجود دارد.سری رقت اول را دور بریزید ، رنگ را به داخل سینک بریزید ، پلیت را زیر شیر اب بشویید پلیت را خشک کنید و تکرار کنید.

 

طیف های رقت ذیل را تمرین کنید.

1. یک طیف رقت سه برابری : حجم 50 ul  ( 25 ul در 50 ul رقیق کننده منتقل میشود)
2. یک طیف رقت 4 برابری : حجم 50 ul ( تقریبا 17 ul در 51 ul رقیق کننده منتقل میشود).
3. یک طیف رقت 5 برابری : حجم 60 ul ( 15 ul در 60 ul رقیق کننده منتقل میشود).
4. یک طیف رقت 10 برابری : حجم 100 ul ( 11 ul در 110 ul رقیق کننده منتقل میشود).
5. یک طیف رقت 5 برابری : حجم 100 ul ( 25 ul در 100 ul رقیق کننده منتقل میشود).

 

9.2.1

اثر سری رقت های مختلف

انتخاب اینکه کدام طیف رقت استفاده شود بستگی به فعالیتی دارد که تیتر میشود .بنابراین اگر مقدار زیادی انتی بادی در سرم وجود دارد آنگاه رقت بالایی برای ارزیابی لازم استم.

ازمایشات مقدماتی در الایزا اغلب شامل تیتراسیون ریاجنت هایی با قدرت نامعلوم است.در چنین مواردی انتخاب مناسب طیف رقتی مهم است.ساده است که طیف رقت دو ، سه ، و چهار برابری ساخت اما مزیت ها کدامند ؟ جدول 4 رقتهای موثر از یک نمونه را با استفاده از طیف رقتی مختلف در هشت چاهک ( هشت مرحله رقت ) ارایه میدهد و طیفی از رقتها را که توسط هر یک پوشش داده میشود را نشان میدهد.

این نشان میدهد که تعدیلی ساده در طیف رقت بطور قابل توجهی رقت نمونه ها را افزایش میدهد.طیف سه یا چهار برابری ، نمونه هایی با غلظت نسبتا بالا را به راحتی تیتر می کند.بنابراین نمونه هایی با تیتر پایین ممکن است مشاهده شوند اما در موارد نمونه های که تیتر بالا دارند نیز مفید است .در مورد طیف دو برابری یک نمونه با تیتر بالا رنگ، در سرتاسر چاهک ها مشاهده میشود و هیچ تیتری مشخص نمی شود.ازمایشات مقدماتی را می توان با طیفهای مناسبتر طبق تیترهایی که در جدول 4 آمده است دنبال کرد.

 

10

مولاریتی

برای ساختن یک محلول 1 مولار از یک ترکیب ما وزن مولکولی آن ترکیب را به گرم برمیداریم و در 1 لیتر (حجم نهایی ) از مایع (معمولا آب مقطر ) حل میکنیم.

بنابراین وزن مولکولی یک ترکیب باید از فرمول اتمی آن محاسبه یا از روی بطری ریاجنت خوانده شود. بعنوان مثال ساده ،سدیم کلراید را در نظر بگیرید(NaCl) .وزن مولکولی 58.5 است.بنابراین 58.5 گرم در 1 لیتر از آب مقطر بیانگر محلول 1 مولار است.یک محول 0.1 مولار حاوی 58.5/10 = 5.85 g/Lاست .

اغلب به حجم زیادی نیاز نداریم بطور مثال 100 ml از یک محلول 1 مولار از NaClحاوی 5.85 گرم از NaCl است از آنجایی که 1 لیتر از 1 مولار حاوی 58.5 گرم است و 100ml=1/10L . بنابراین ما 10 برابر کمتربه NaCl نیاز داریم .

راه دیگر برای محاسبه این است که همیشه مقدار ماده شیمیایی مورد نیاز را که مولاریتی در یک میلی لیتر را به ما میدهد محاسبه کنیم.بنابراین 1 M= 58.5g/L = 0.0585g/mL . اگر ما 50 mL محلول 1M نیاز داشته باشیم بنابراین 50 *0.0585g در 50 ml نیاز داریم .این روش در محاسبه مولاریتی های سختترما را کمک میکند.

برای مثال ما یک محلول 0.125 M از NaCl در 35 mL نیاز داریم .تعداد گرم ها در میلی لیتر در مولاریتی مورد نیاز را محاسبه کنید: 1 M =58.5g/L, 0.125M=58.5/8=7.35g/L =0.0073g/ml. . ما در حجم نهایی 35ml نیاز داریم .بنابراین 35*0.0073=0.256g.

برای محلول 2 مولار ما دو برابر وزنی که برای محلول 1 مولار لازم است نیاز داریم که درمورد NaCL معادل 117 g/L می شود.اگر ما 17 mL از یک محلول 2 مولار NaClنیاز داشته باشیم ، 2M NaCl=117.0g/L = 117/1000=0.117g/mL . ما 17 mL  نیازداریم پس 0.117 * 17 = 1.99 g .

  کسری از مولاریتی با ارزیابی مقدار مورد نیاز برای یک mL بهتر محاسبه می شود برای مثال ما یک محلول 0.15 M از NaCl در 25mL نیاز داریم.بنابراین 1 M NaCl=58.5g/L , 1.5M=1.5*58.5g/l=87.75g/L,0.15M=87.5/10=8.75g/L=0.0088g/mL.

به این ترتیب ما برای 25 mL به  25*0.0088g=0.22g نیاز داریم.

گاهی اوقات مولاریتی به صورت میلی مولار بیان میشود مانند 100mM ،10mM ، 30mM ،. یک میلی مولار =1/1000M  .بنابراین برای NaCl 58.5/1000=0.0585g/L=1mM .

به این ترتیب یک محلول 10mM حاوی 0.585g/L و یک محلول 10mM حاوی 5.85g/L است.