فلورومتری (Flourometry)

 

فلورومتری (Fluorometry)

 

فلورسانس به وضعیتی گفته میشود که یک مولکول نور را در یک طول موج جذب کرده و در طول موجی بلندتر گسیل میکند.اتم یا مولکولی که فلورسانس میکند فلوروفور (fluorophore) نامیده میشود. فلورومتری به اندازه گیری نور فلوروسنت گسیل شده گفته میشود.آنالیز فلورومتری یک روش تحلیلی کمی است در علوم شیمیایی و زیستی و تکنیکی بسیار حساس و درست است.

 

 

مفهوم های پایه (Basic Concepts)

 

 شکل 10-10 ارتباط بین جذب ، فلورسانس و فسفرسانس را نشان میدهد. همانطور که نشان داده شده است هر مولکول یک سری از ترازهای انرژی نزدیک به هم دارد. جذب یک کوانتوم از انرژی نوری توسط یک مولکول سبب انتقال یک الکترون از حالت پایه منفرد به یکی از  اولین ترازهای ارتعاشی اش میشود.

شمار واقعی مولکولها در حالت تحریک شده با یک منبع نوری 150 W بسیار کم و براورد شده است که 10^-13 مول به ازای یک مول فلوروفور باشد.وقتی یک مولکول در حالت تحریک شده باشد به چند روش به وضعیت انرژی ابتدایی اش باز میگردد. 1- تعادل ارتعاشی بدون تابش 2- با فلورسانس از حالت تحریک شده  3-خاموش شدن (quenching) حالت تحریک شده  4- جابجایی تقاطعی به یک تراز انرژی با حالت سه گانه  5- خاموش شدن (quenching) از تراز انرژی با حالت سه گانه  6- با فسفرسانس از تراز انرژی دارای حالت سه گانه

همانطور که در شکل 10-10 نشان داده شده است تعادل ارتعاشی (vibrational equilibration) پیش از فلورسانس سبب از دست رفتن مقداری از انرژی تحریکی میشود . بنابراین نور گسیل شده از فرایند فلورسانس(emission light)  طول موج بالاتری از نور تحریک کننده (excitation light) دارد. اختلاف بین بیشترین طول موج تحریک کننده و بیشترین طول موج گسیل شده از فلورسانس یک ثابتی است که به آن stokes shift میگویند.این ثابت اندازه ای از انرژی از دست رفته طی طول عمر وضعیت تحریک شده (lifetime of excited state) پیش از بازگشت به تراز انرژی پایه ای اش است ( گسیل فلورسانس ).

 

ارتباط های زمانی گسیل فلورسانس (time relationships of fluorescence emission)

زمانی که لازم است تا یک مولکول انرژی تابشی را جذب کند و به وضعیت تحریک شده برسد بطور براوردی 10^-15 ثانیه است . طول زمانی که تعادل ارتعاشی رخ میدهد تا به پایین ترین تراز انرژی تحریک شوندگی (lowest excited state) برسد براورد شده که 10^-14 تا 10^-12 ثانیه باشد. زمان لازم برای رخ دادن گسیل فلورسانس 10^-8 تا 10^-7 ثانیه است . همانطور که می بینید تاخیر زمانی قابل توجهی بین 1- جذب انرژی نوری 2-بازگشت به پایین ترین تراز انرژی تحریک شدگی 3- گسیل نور فلورسانس وجود دارد. این ارتباط های زمانی در شکل 10-11 نشان داده شده است .

در این شکل فاز 1 نمایانگر دوره زمانی بین جذب انرژی نوری و از دست رفتن انرژی بدون تابش طی بازارایی ارتعاشی به پایین ترین تراز انرژی وضعیت تحریک شده است.این دوره زمانی با فلش های رو به بالا و رو به پایین در نمودار نمایش داده شده اند.

فاز 2 گسیل و نیز زوال گسیل دو نوع فلوروفور کوتاه عمر (short lived ) و بلند عمر (long lived) را نشان میدهد.اگر گسیل فلورسانس پس از تابش یک منبع تحریک کننده مانند لامپ زنون یا لیزر ، در طول زمان اندازه گیری شود ، زوال شدت نور گسیل شده یک فرایند از درجه اول و مانند زوال رادیواکتیو است ( فاز 2 از شکل 10-11 ).زمان لازم برای رسیدن نور گسیل شده به 1/e شدت نور ابتدایی اش (e ، پایه ناپریان و برابر با 2.718 است ) میانگین طول عمر وضعیت تحریک شده یا زمان زوال فلورسانس نامیده میشود.

از تاخیر زمانی بین جذب کوانتوم های انرژی و فلورسانس در دستگاهی کردن فلورسانس استفاده میشود که فلورومتری زمانبندی شده (time resolved flourometry) نامیده میشود.

 

Time resolved flourometry ، بسته به اینکه گسیل فلورسانس چگونه اندازه گیری شود به دو دسته تقسیم بندی میشود.

 

1-        فلورومتری پالسی(puls flourometry) : که در آن نمونه با یک پالس مختصری از نور درخشان شده و شدت گسیل فلورسانس به شکل تابعی از زمان به وسیله یک سیستم تشخیصی سریع (fast detector system) اندازه گیری میشود. 2 – فلورومتری فازی (phase flourometry) : که در آن یک منبع تابش پیوسته لیزر نمونه را درخشان میکند و گسیل فلورسانس طی زمان پایش از نظر پالس و فرکانس پایش میشود.

 

 

ارتباط غلظت با شدت فلوروسانس

ارتباط غلظت با شدت گسیل فلورسانس از قانون بییر – لامبرت گرفته میشود .با گسترش به شیوه سری تی لور (taylor series) ، بازآرایی ، تبدیل پایه لگاریتم ، و فرض پایه درباره محلولهای رقیق ، برابری زیر بدست می آید.           

 

F  = شدت نسبی فلورسانس (relative fluorescence intensity)

ϕ  = کارایی فلورسانس ( fluoroscence efficiency) ( یعنی نسبت بین کوانتوم های نور گسیل شده و کوانتوم های نور جذب شده )

I0 = شدت تحریک اغازین (initial excitation intensity)

a = جذب مولی (molar absorptivity)

b  = عنصر حجم که از ساختار فضایی روزنه های تحریک و گسیل تعریف میشود.

c  = غلظت بر اساس مول در لیتر  mol / L   

معادله نشان میدهد که شدت فلورسانس بطور مستقیم متناسب است با غلظت فلوروفور و شدت تحریک (excitation intensity) .این برابری تنها برای محلولهای رقیق برقرار است که در آن اندازه جذب کمتر از 2 % تابش تحریک کننده است .

شدت فلورسانس در صورتی که جذب محلول به بالای 2% تابش تحریک کننده برسد غیر خطی میشود. فاکتورهای دیگری که بر اندازه گیری شدت فلورسانس اثر میگذارند شامل حساسیت آشکار ساز و میزان پراکنش نور پس زمینه است که آشکارساز شناسایی کرده است.

اندازه گیری شدت فلورسانس حساستر از اندازه گیری جذب است . بزرگی جذب یک رنگزا در محلول با غلظت آن و طول مسیر کووت تعیین میشود. بزرگی شدت فلورسانس یک فلوروفور با غلظت آن ، طول مسیر و شدت منبع تابش تعیین میشود.حساسیت اندازه گیری فلورسانس می تواند از 100 تا 1000 برابر بزرگتر از حساسیت اندازه گیری جذب باشد به علت استفاده از منبع های نوری شدید ، تکنیکهای دیجیتال فیلتر کردن سیگنال و آشکارسازهای بسیار حساس تابشهای گسیل شده . همه این ها در دستگاه های اسپکتروفلورومترهای معمولی گنجانده شده اند.

بیشتر ، اندازه گیری فلورسانس بر پایه واحدهای (یکاهای ) شدت نسبی بیان میشود. واژه نسبی (relative) برای این استفاده میشود که شدت اندازه گیری شده یک مقدار مطلق نیست . و بخش کوچکی از همه فلورسانس گسیل شده است. و بزرگی این مقدار به وسیله پهنای روزنه دستگاه ، حساسیت اشکارساز ، کارایی تک فام ساز و شدت تابش تحریک کننده تعیین میشود . چون این متغیرها وابسته به دستگاه است بنابراین تعیین یک واحد شدت مطلق برای یک غلظت معین از یک فلوروفور که از یک دستگاه تا دستگاهی دیگر با ارزش باشد اگر ممکن نباشد سخت است.

 

 

دستگاهی کردن(instrumentation)

فلورومترهای و اسپکتروفلورومترها برای اندازه گیری فلورسانس بکار میروند. از نظر عملکردی یک فلورومتر از فیلترهای تداخلی ، فیلترهای شیشه ای ، گریتینگ ها و یا منشورها بهره میگیرند تا نور تک فام  تولید کرده و به وسیله آن نمونه مورد نظر را تحریک (excitation) و یا گسیلهای فلورسانس (emission) را جدا سازی نمایند.

 

 

بخش ها (components)

 بخش های پایه ای فلورومترها و اسپکتروفلورومترها شامل 1- یک چشمه نور تحریک کننده (excitation source)  2- تک فام ساز

نور تحریک کننده (excitation monochromator)  3- یک کووت  4- تک فام ساز فلورسانس گسیل شده (emission monochromator)  5- یک آشکار ساز (detector) .

 

چشمه نور تحریک کننده (excitation source)

گستره جذبی بیشتر ترکیب های فلورسانت پرکاربرد در بازه 300 nm تا 700 nm است . شدت فلورسانس گسیل شده متناسب است با شدت نور تحریک کننده ابتدایی ، با غلظت و با اندازه حجم سلول نمونه .بنابراین یک لامپ پر شدت که توانایی گسیل انرژی در یک گستره وسیع داشته باشد بسیار خوب است. چشمه های نوری تحریک کننده که در فلورومترها و اسپکتروفلورومترها بکار میروند شامل لامپها و لیزرهای زنون ، کوارتز هالوژن ، و جیوه ای هستند. بعضی از این چشمه های نوری گستره پرشدتی از یک یا چندین طول موج را فراهم میکنند و بعضی دیگر گستره پیوسته ای از طول موجهای مورد نظر را .

 

 

لامپ زنون (xenon lamp)

لامپ زنون یک چشمه نوری دوست داشتنی برای تحریک کردن است چون در گستره پیوسته ای از 250 nm  تا 800 nm  طول موجهای نسبتا پر شدتی را می تاباند. لامپ زنون به این خاطر پرکاربرد است که برون ده انرژی بالا ، پایداری فلاش لامپ و برون ده بسیار بالایی در گستره فرابنفش و نور مرئی دارد.این فلاش لامپ ها می توانند تا 2500  پالس در ثانیه پالس تولید کنند.طول عمر این فلاش لامپها از 10^6 تا 10^9 فلاش به همراه پایداری در در گستره نور تابشی متغیر است .

 

 

لیزرها (lasers)

چشمه های نوری لیزر که در بخش اسپکتروفوتومتری به آن پرداخته شده است در اندازه گیری فلورسانس نیز بسیار پرکاربرد است چون بسیار پر شدت ، بسیار متمرکز و در اساس تک فام هستند. از کاربردهای آن میتوان فلورومتری زمان بندی شده (time resolved fluorometry) ، فلوسایتومتری(flowcytometry)  ، میکروسکوپی لیزر پالسی (pulsed laser confocal microscopy)، فلورومتر القاشده با لیز (laser induced fuorometry) و اندازه گیری پراکنش نور برای اندازه و شکل را نام برد.انواع مختلفی از لیزرها به عنوان چشمه های نوری در اندازه گیری فلورسانس موجود است (جدول 10- 3)  را ببینید.

 

تک فام سازهای تحریک (excitatation monochromator) و تک فام سازهای گسیل (emission monochromator)

تک فام سازهایی که در دستگاههای فلورومتری استفاده میشوند شامل فیلترهای تداخلی ، فیلترهای شیشه ای رنگی ، گریتینگ ها و منشورها هستند. هر نوع فیلتری که انتخاب شود با فیلترهای شیشه ای نوع شارپ کات آف (sharp cutoff filter) ترکیب میشوند و یک بسته فیلتری واحدی را شکل میدهند که پهنای باند باریک ایجاد میکنند ، عبور طول موجهایی با قله های بالاتری را فراهم میکنند و شیب این باندها را نیز افزایش میدهند.

فیلترهای شیشه ای رنگی طول موجهای معینی از نور را به طور انتخابی جذب میکنند.از این فیلترها در هر دو بخش تحریک (excitation) و گسیل (emission) استفاده شده است .اما این فیلترها به نورهای ناخواسته (stray light) و فلورسانس ناخواسته حساس هستند.

تکفام سازهای نوع گریتینگ ابزارهایی هستند که بخشهایی از یک طیف را جدا میکنند. توان جداسازی (resolution) طیفی نور در در روزنه وابسته به پهنای روزنه (slit width) و توان جداسازی گریتینگ دارد. بطور کلی اسپکتروفلورومترها پهنای روزنه بزرگتری را نسبت اسپکتروفتومترهای جذبی بکار میگیرند تا شدتهای تحریک بالاتری را ایجاد کنند.یک مزیت تکفام سازهای نوع گریتینگ آن است که در هنگام بکارگیری از فلوروفورهای جدید با ماکزیمم جذب و گسیل جدید که فیلترهای تداخلی برای آنها ساخته نشده است میتوانند طول موجهای تحریک و گسیل بسیار انتخابی را فراهم کنند. در کاربری های معمولی با یک اسپکتروفلورومتر طول موج تحریک یا طول موج گسیل ثابت نگه داشته شده و دیگری پایش (اسکن ) میشود. در دستگاه های بسیار خودکار شده تکفام سازهای تحریک و تکفام سازهای گسیل همگام شده و با یک سرعت برنامه ریزی شده باهم اسکن میشوند. این نوع از دستگاهی کردن این امکان را فراهم میکند که تغییر در شدت گسیل را به شکل تابعی از در طول موجهای تحریک و طول موجهای گسیل داشته باشیم و این یک بعد دیگری از اختصاصیت را به اندازه گیریهای فلورسانس میدهد. لیزرها بخاطر قدرت تکفام سازی بالای آنها هم به عنوان چشمه نوری تحریک و هم به عنوان تک فام ساز بکار میروند.

 

 

 

کووت (Cuvet)

همانند طیف سنجهای جذبی در روش فلورومتری نیز کووت ها بکار گرفته میشوند تا نمونه مایع را در خود نگه دارند.در دستگاه های فلورومتر کووتها مربع یا چند ضلعی هستند و از موادی ساخته شده اند که نور تحریک یا نور گسیل را عبور میدهند ( جنس شیشه یا پلاستیک برای نورهای قابل دیدن و جنس کوارتز برای نور فرابنفش ) .

در فلورومترها و اسپکتروفلورومترها جایگذاری کووت و مسیر نور تحریک کننده نسبت به آشکار ساز در ساختار هندسه نوری اندازه گیری فلورسانس بسیار مهم است.از آنجایی که نور فلورسانس از یک مولکول در همه جهت ها گسیل میشود برای همین چندین جهت گیری فضایی تحریک / گسیل در اندازه گیری فلورسانس بکار گرفته میشود.(شکل 10-13) . اگر چه ساختار دو سر در روبرو (end on approach) انطباق آشکار ساز فلورسانس را با دستگاه های جذبی 180 درجه موجود را فراهم میکند اما به خاطر کاهش حساسیت این ساختار بکار گرفته نمیشود. کاهش حساسیت به علتهایی مانند کیفیت فیلترهای تداخلی بخش تحریک و یا بخش گسیل ، هم پوشان شدن باند طیفی نورهای تحریک و نورهای گسیل و به علت اثر فیلتر درونی رخ میدهد.بیشتر فلورومترها و اسپکتروفلورومترها از ساختار آشکار ساز در زاویه راست بهره میگیرند تا سیگنال پس زمینه را کاهش دهند و حساسیت آنالایتیکال را کوچکتر کنند.

 

ساختار front surface به دلیل کمتر کردن اثر فیلتر داخلی ،یشترین خطی بودن (linearity) را در بازه گسترده ای از غلظت فراهم میکند. ساختار front surface حساسیتی برابر با ساختارهای آشکارساز در زاویه راست دارند اما به پس زمینه پراکندگی نور حساس هستند.فلورومتری front surface به طور گسترده ای در سیستم های سنجشی ایمونوفلورسانس ناهمگون دارای فازجامد بکار برده میشود.

 

 

برای جور دراوردن این ساختارهای مختلف ، سلول نمونه در ارتباط با چشمه نوری تحریک کننده و آشکارساز ، در زاویه های مختلف جهت دهی میشود .بیشترین نگرانی در ارتباط با ساختار سلول نمونه ، پراکنش نور ، اثر فیلتر درونی ، و عنصر حجم نمونه است که به وسیله آشکار ساز دیده میشود.شکل 10-14 A یک فلورسانس اسپکتروفوتومتر را نشان میدهد که روزنه بخش تحریک و روزنه بخش گسیل در یک زاویه راست نسبت به هم قرار گرفته اند. جایگاه روزنه گسیل و پهنای روزنه بسیار مهم است . اگر روزنه گسیل نزدیک روبروی لبه سلول نمونه قرار بگیرد همانطور که در 10-14 B نشان داده شده است ، اثر فیلتر درونی به کمترین مقدار میرسد. اگر پهنای روزنه گسیل افزایش یابد، حساسیت افزایش می یابد اما اختصاصیت ممکن است کاهش یابد.

 

 

آشکارسازهای نوری (photodetectors)

همانند اسپکتروفتومترها ، دستگاه هایی به عنوان آشکارساز در فلورومترها بکار میروند.علاوه بر این دستگاه ها امکان دیدن بصورت چشمی نیز وجود دارد.

 

 

دیدن با چشم (visual observation)

از آنجایی که چشم انسان یک آشکار ساز حساس با گستره پهنی در شناخت طیفهای نوری است ، روشهای کروماتوگرافی لایه نازک فلوروسنت (روشهای کیفی ) در آزمایشگاه های بالینی از چشمه های نوری فرابنفش با طول موجهای کوتاه و بلند و جفت کردن آنها با گستره طول موجی قابل دیدن با چشم ، بهره گرفته اند.

 

 

لوله تکثیر فوتون (photomultiplier tube)

در سنجش های کمی بیشترین آشکارسازی که در فلورومترها و اسپکتروفلورومترها بکار میرود فوتومالتی پلایر تیوب ها هستند.مهمترین ویژگی های فوتومالتی پلایر تیوبها در اندازه گیریهای فلورسانس شامل 1) امکان انتخاب های زیاد در پاسخ های طیفی 2) زمان پاسخ فوتون در نانوثانیه 3) حساسیت (sensitivity) است .حساسیت به خاطر امکان بدست آوردن 10^6 فوتون در اند فوتومالتی پلایر به ازای برخورد یک فوتون در بخش کاتدی فوتومالتی پلایر است.

بسته به درجه نوری (جریان نور)که به کاتد فوتومالتی پلایر برخورد میکند و بسته به حساسیت طراحی شده ، اندازه گیری جریان الکترون در اند فوتومالتی پلایر به روشهای مختلفی انجام میشود.در نورهای با شدت بالا تکنیکهای انالوگ برای اندازه گیری جریان فوتومالتی پلایر بکار برده میشود. سیگنال انالوگ برای استفاده در کامپیوتر یا صفحه نمایش دیجیتال به سیگنالهای دیجیتال تبدیل میشود.در نورهای با درجه پایین افزایش های ناگهانی یا پالسها که در کاتد فوتومالتی پلایر ایجاد شده اند ، شمارش میشوند. شمار پالسهایی که در ازای واحد زمان رخ میدهد بطور مستقیم متناسب است با شدت نور فلورسانس گسیل شده که به فوتومالتی پلایر برخورد میکند. این شیوه، شمارش فوتون (photon counting) نامیده میشود. بکارگیری روش شمارش فوتون، میزان نسبت سیگنال به نویز را افزایش و پایین ترین حد تشخیص را بیشتر کاهش میدهد در نتیجه اندازه گیری فلوروفورها در غلظتهای بسیار پایین فراهم میشود.

 

 

 

Charge-Coupled Detector

این نوع از آشکارسازها دارای نسبت سیگنال به نویز بسیار بهتری نسبته به فوتومالتی پلایر تیوب ها هستند.این دستگاه ها حالت جامد داشته و در دو محور افقی و عمودی سیگنالهای آن خوانده میشود. این نوع از آشکارسازها اول بار در کابری های ستاره شناسی و در تلسکوپهای نوری نصب شده در سطح زمین بکار گرفته شدند چون اندازه گیرهای حساس نورهای بسیار پایین مورد نیاز بود.بخاطر این توانایی در تشخیص نورهای بسیار پایین ، از آنها در اندازه گیری های فلورسانس مولکولی غلظتهای بسیار پایین فلوروفورها بکار گرفته شد.

 

 

اطمینان از کارایی (performance verification)

همانند اسپکتروفوتومترها ، NIST شماری SRM را برای کالیبرکردن یا اطمینان از عملکرد صحیح فلورومترها و اسپکتروفلورمترها فراهم کرده است . این ها شامل SRM 936a ( quinine sulfate dehydrate) و SRM 1932( fluorescein) برای ایجاد یک درجه بندی مرجع در اندازه گیری فلورسانس میباشد.

 

 

انواع فلورومترها و اسپکتروفلورومترها

فلورومترها و فلورسانس اسپکتروفوتومترهایی که ویژگی هایی یکتا ارایه میدهند هم اکنون موجود هستند.این ویژگی ها شامل ratio referencing ، تکفام سازهای تحریک و تکفام سازهای گسیل کنترل شده با میکروپروسسور ، چشمه نوری لامپ زنون پالس دار شده ، شمارنده فوتون (photon counting) ، سلولهای رودامین برای طیفهای اصلاح شده ، پولارایزر ها ، سلولهای حاوی جریان (flow cells) ، اداپتور به حالت front-surface ، دارای چندین جایگاه سلول ، سیستم های تحلیل داده ها بر پایه میکروپروسسور.

 

علاوه بر این اسپکتروفلومترهای پایه ای که گفته شدند دیگر دستگاه های فلورمتری عبارتند از ratio-referencing spectrofluorometer ، time-resolved spectrofluorometer ، flow cytometer ، hematofluorometer .

 

Ratio-Referencing Spectrofluorometer

یک نمونه از اسپکتروفلورومتر ratio-referencing در شکل 10-15 نشان داده شده است. پایه این دستگاه از آشکار ساز زاویه راست بهره میگیرد و دو تک فام ساز (M1 و M2) در آن بکار رفته است ، دو فتومالتی پلایر (D1 و D2 ، فتومالتی پلایر رفرانس و فتومالتی پلایر نمونه ) و یک چشمه نوری لامپ زنون .نور از تکفام ساز تحریک کننده (M1) جدا میشود و بخش کوچکی از آن (10%) به سمت فتومالتی پلایر رفرانس (D1) به منظور نسبت گیری با یک مرجع (ratio referencing) تابیده میشود. بخش بیشتر نور تحریک کننده به کووت نمونه (C)تابانده میشود . بخش گسیل در یک زاویه راست با بخش تحریک قرار گرفته است.یک تکفام ساز گسیل (M2) به گونه ای گزینش میشود که بخش دلخواه از گستره نور گسیل شده را انتخاب و اسکن کند و به فتومالتی پلایر نمونه (D2) برای اندازه گیری شدت نور گسیل شده بتاباند.سیگنالهای فتومالتی پلایر رفرانس و نمونه ،تکثیر شده (A1 و A2) و نسبت سیگنال نمونه به سیگنال رفرانس در یک صفحه نمایش دیجیتال یا یک ثبت کننده منحنی فرستاده میشود.

Ratio-referencing  فلورومتری بیشتر برای اندازه گیری غلظت در طول موجهای دلخواه از تحریک و گسیل بکار گرفته میشود.

اندازه گیری با این روش در یک تنظیم های ثابت از طول موجهای تحریک و گسیل برای سنجش غلظت انجام میشود و یا به گونه ای دیگر از این روش میتوان برای بدست آوردن اسپکتروم (طیف ) تحریک و گسیل یک ترکیب دلخواه بهره گرفت .اندازه گیری غلظت یک نمونه همانند یک فلورومتر تک پرتوی انجام میشود.یک محلول بلانک و یک محلول کالیبراسیون ابتدا اندازه گیری میشوند و بعد نمونه های مجهول. این اسپکتروفلورومترها بر اسپکتروفلورومترهای تک پرتوی دارای دو برتری است . اول این که نوسان های کوتاه و بلند مدت انرژی لامپ زنون را برطرف میکند و با این شیوه نیاز به کالیبراسیون چند باره دستگاه در هنگام آنالیز نیست. دوم اینکه طیف های تحریک اصلاح شده را با جبران نوسان های انرژی وابسته به طول موج فراهم میکند.

 

 

فلورومتری زمان بندی شده (Time-Resolved Fluorometer)

فلورومتری زمان بندی شده در میانه دهه 1970 ارایه شد.وایدر یک فلورومتر لیزر نیتروژن پالس دار شده را در ترکیب با یک سیستم ایمونو اسی بر پایه لانتانید ارایه داد تا زوال فلورسانس چلات (chelates) های لانتانید را به عنوان وسیله ای برای حذف تداخل های پس زمینه ناشی از پراکنش نور و ترکیب های فلورسانس با زمان زوال کوتاه اندازه بگیرد. فلورومتر زمان بندی شده همانند فلورومتر ratio-referencing است با این تفاوت که چشمه نوری پالس دار شده است و آشکار ساز در حالت شمارش سریع فوتون، زوال سیگنالهای فلورسانس را که به شکل تابعی از توان e است پس از تحریک اندازه میگیرد.فلورومتری زمان بندی شده نیازمند بکار گیری فلوروفورهای بلند مانا (long-lived fluorofores) مانند لانتانید(عنصر خاکی کمیاب ) ، عنصر های فلزی یوروپیوم (Eu3+) و ساماریوم (Sm3+) است.در حالی که بیشتر ترکیب های فلورسانس زمانهای زوال 5 تا 100 نانوثانیه دارند ، چلاتهای یوروپیوم در 0.6 تا 100 ثانیه زوال می یابند.بنابراین سنجش های فلورسانس زمان بندی شده از مزیت تفاوت در طول عمر فلوروفور و فلورسانس پس زمینه با اندازه گیری سیگنال زوال یابنده فلورسانس بهره میگیرد. این روش تداخل های پس زمینه را حذف میکند و همزمان از سیگنال ها میانگین گیری کرده و دقت اندازه گیری را افزایش میدهد. به حد تشخیص (detection limit) نزدیک به 10^-13 mol/L با فلورومتری زمان بندی شده میتوان دست یافت . این رقمی برابر با چهار برابر بهتر از حد تشخیص به وسیله فلورومترهای معمولی است.برای نمونه نانوپارتیکل های نشاندار شده با یوروپیوم (Eu3+) در ترکیب با فلورومتری زمان بندی شده بکار رفته اند تا یک سنجش بسیار حساس بر پایه ایمونواسی برای اندازه گیری انتی ژن اختصاصی پروستات تام و آزاد را با حساسیت 0.5 ng/L اندازه گیری کنند.

 

فلوسایتومتر (Flow Cytometer)

سایتومتری به اندازه گیری ویژگی های فیزیکی و شیمیایی سلول ها ، یا بطور کلی ذره های زیستی گفته میشود.فلوسایتومتری فرایندی است که چنین اندازه گیریها زمانی که سلول ها یا ذره ها در یک جریان مایع ، ترجیحا به شکل یک نوع ذره زیستی (single file) از دستگاه اندازه گیری عبور میکنند ، انجام میشود.

در عمل ، فلوسایتومتری ، فلورومتری تحریک شده با لیزر را با انالیز پراکنش نوری ذره ها ترکیب میکند و به این وسیله دسته های مختلف مولکولها ، سلول ها یا ذره ها از نظر اندازه ، و شکل با بکارگیری نور کم (low-light)و پراکنش نور در زاویه راست (right-angle light scattering) از همدیگر تشخیص داده میشوند.استفاده از لیزر در پراکنش نوری با زاویه کم در اینجا بسیار جور درامده است .این سلول ها ، مولکولها، یا ذره ها با نشانهای فلورسنت ویژه ای مانند بتا – فیکواریترین (β-phycoeythrin) ، فلورسیین ایزوتیوسیانات (fluorescein isothiocyanate) ، رودامین (rhodamine-6G) و دیگر انتی بادی های نشاندار شده با رنگ ، نشاندار میشوند.این ذره های زیستی همینطور که از سلول نمونه همراه با جریان ، عبور میکنند اندازه گیری های فلورسانس و پراکنش نوری همزمان به وسیله فلوسایتومتر انجام میشود.بیشتر فلوسایتومترها از دو یا چند سیستم آشکارسازی گسیل فلورسانس بهره میبرند تا چندین نشان فلورسانت را بتوانند شناسایی کنند.یک طرح از فلوسایتومتر در شکل 10-16 نشان داده شده است.

 

بیشتر فلوسایتومترهای بازار از یک یا چند چشمه نوری لیزر بهره میگیرند.برای مثال LSR II(BD Biosciences,Rockville,MD)  میتواند با هفت لیزر تجهیز شود (355nm(UV),405nm,488nm,532nm,594nm,638nm,785nm) و همزمان 18 طیف گسیل را اندازه بگیرد.

فلوسایتومترها میتوانند چندین ویژگی را اندازه گیری کنند مانند 1) اندازه سلول 2) میزان دانه دار بودن (پراکنش در 90 درجه )  3) محتوای DNA  4) محتوای RNA  5) نسبت نوکلئوتیدهای DNA (A+T  /  G+C)  6) ساختار کروماتین  7) انتی ژنها  8) کل محتوای پروتیین  9) گیرنده های سلول  10)پتانسیل غشایی 11) غلظت یون کلسیوم به شکل تابعی از pH . از این ویژگی ها در هماتولوژی، ایمونولوژی ( مانند زیرگروههای سلول T ، تعیین گروه بافتی ، تحریک لیمفوسایت ، و واکنشهای انتی ژن – انتی بادی ) ، انکولوژی ( مانند تشخیص ، پیش آگهی و پیگیری درمان ) ، میکروب شناسی ( شناسایی باکتری ها و حساسیت به انتی بیوتیک ها ) ، ویروس شناسی ، ژنتیک ( مانند کاریوتایپینگ و تشخیص وضعیت حامل ) انگل شناسی و بررسیهای تولید مثل و باروری. فلوسایتومتری همچنین کاربردهای پرتوانی در طراحی فلوروایمونواسی های حساس القا شده با لیزر دارد. فیکواریترین یک مولکول فیکوبیلی پروتیین (phycobiliprotein) بزرگ است با وزن مولکولی 250kD که هم ارز است با 25 مولکول رودامین و نیز دارای یک اسپکتروم گسترده از 530nm تا 630nm و همچنین دارای ویژگی low photodecomposition است.این مولکول یک نشان عالی برای سلولها و برای فلوروایمونواسی های جدید است.

شایان ذکر است که از سنجش های فلوسایتومتری بر پایه ذرات (particle-based flow cytometric assays) نام برد. با این فن اوری یک فلوسایتومتر با ذره های کروی بسیار ریز (microspheres) که به عنوان پایه جامد نگه دارنده (solid support) در ایمونواسی معمولی(convetional immunoassay)، سنجش بر پایه میل ترکیبی (affinity assay) ، و سنجش هیبریدازیسیون DNA (DNA hybridization assay) .نتیجه چنین سیستم هایی منتهی به طراحی سنجش های چندگانه (multiplex assay) شده است که به طور همزمان چندین آنالیت مختلف را در حجم کمی از نمونه اندازه میگیرد.

 

محدودیت های اندازه گیری فلورسانس

عامل هایی که بر اندازه گیری فلورسانس اثر دارند شامل اثر غلظت ( مانند اثر فیلتر درونی ، خاموش کنندگی غلظت (concentration quenching) ) ، اثر پس زمینه (پراکنش Rayleigh & Raman) ، اثر حلال ( فلورسانس غیر اختصاصی تداخل کننده ، خاموش کنندگی حلال (solvent quenching) ) ، اثر نمونه ( مانند پراکنش نور ، فلورسانس تداخل کننده ، جذب نمونه )، اثر دما و فتودکامپوزیشن (bleaching)  نمونه میباشد.

 

اثر فیلتر درونی (inner filter effects)

رابطه خطی بین غلظت و گسیل فلورسانس هنگامی درست است که محلولهایی که کمتر از 2% نور تحریک کننده را جذب میکنند بکار گرفته شوند. همینطور که جذب محلول از این مقدار افزایش یابد ، رابطه نیز غیر خطی میشود ، پدیده ای که به آن اثر فیلتر درونی میگویند.این پدیده ناشی از دست رفتن شدت تحریک کنندگی در سراسر طول مسیر کووت است چون نور تحریک کننده به وسیله فلوروفور جذب میشود. بنابراین همینطور که فلوروفور بیشتر غلیظ میشود ، جذب شدت تحریک کنندگی افزایش یافته و نور تحریک کننده به هنگام گذر از کووت، بیشتر از دست میرود. این اثر بیشتر در دستگاه های فلورسانس زاویه راست دیده میشود که در آنها روزنه های بخش گسیل مرکز سلول نمونه را پایش میکنند جایی که جذب نور تحریک کننده بیشتر از وضعیت front surface است. بنابراین دستگاه های فلورسانس front surface کمتر دچار این مشکل هستند. با این حال بیشتر اندازه گیری های فلورسانس در محلول های خیلی رقیق انجام شده و بنابراین اثر فیلتر درونی مشکل به شمار نمیاید.

 

اثر خاموش کنندگی غلظت (concentration quenching)

پدیده دیگری که سبب برون ده کوانتومی پایین تر (lower quantum yeield) نسبت به آنچه که پیش بینی میشود اثر خاموش کنندگی غلظت (concentration quenching) است. این پدیده هنگامی رخ میدهد که یک ماکرومولکول مانند آنتی بادی ، با شمار زیادی فلوروفور مانند فلورسئین ایزوتیوسیانات نشاندار و سنگین شود. هنگامی که این ترکیب تحریک شود ، نشان های فلورسانس چنان به هم نزدیک هستند که انتقال انرژی بدون تابش رخ میدهد.بنابراین برون ده فلورسانس بسیار پایین تر است از آنچه که برای غلظت نشان ها  پیش بینی میشود .این یک مشکل معمول در فلوسایتومتری و فلورسانس القا شده به وسیله لیزر در هنگامی است که تلاش میشود تا حساسیت تشخیصی را با افزایش تراکم نشانهای فلورسانس کننده افزایش دهند.

 

 

پراکنش نور (light scattering)

پراکنش نور – Rayleigh and Raman – کاربرد فلورسانس را در اندازه گیری محدود میکند. پراکنش Rayleigh هنگامی که تغییری در طول موج رخ ندهد پیش میاید. برای فلوروفورهایی با stokes shift های کوچک طیف تحریک و طیف گسیل هم پوشانی داشته  و بخاطر پراکنش نوری پس زمینه ، مستعد از دست رفتن حساسیت میشود.

پراکنش Raman هنگام بلند شدن طول موج رخ میدهد.این نوع از پراکنش نوری مستقل از طول موج تحریک است و از ویژگی های حلال به شمار می اید.

 

 

اثر جنس کووت و اثر حلال

شماری از شیشه ها از جنس کوارتز و موادی از جنس پلاستیک که جذب کننده های نور فرابنفش را در خود دارند ، فلورسانس میکنند.بعضی حلال ها مانند اتانول فلورسانس قابل توجهی ایجاد میکنند.بنابراین در هنگام طراحی یک سنجش فلورسانس باید فلورسانس پس زمینه تمام بخش های واکنش را ارزیابی نموده و به شمار آورد.

خاموش شدن (quenching) به وسیله حلال یک مشکل بوده و ریشه در برهم کنش فلوروفور با حلال یا با دیگر مواد حل شده در حلال دارد.چنین برهم کنش هایی منتهی به از دست رفتن فلورسانس به وسیله انتقال انرژی و یا مکانیسم های دیگر میشود اما روی طیف جذبی فلوروفور ندارد.نمونه ای از کوونچینگ از دست رفتن فلورسانس در هنگام اضافه شدن هالیدها به محلول کینین (quinine) در سولفوریک اسید رقیق است.

 

اثر ماتریکس نمونه (sample matrix effects)

نمونه سرم یا نمونه ادرار دارای شمار زیادی ترکیب هایی است که فلورسانس میکند. بنابراین ماتریکس نمونه یک سرچشمه ناخواسته فلورسانس میتواند باشد و در طراحی یک سنجش جدید بر پایه فلورسانس باید در نظر گرفته شود.جدی ترین منبع های فلورسانس ناخواسته پروتیین ها و بیلی روبین است .با این حال چون تحریک ماکزیمم پروتیین در گستره 260 nm تا 290nm  است ، همکاری آنها در همه فلورسانس پس زمینه هنگامی کم ترین خواهد بود که تحریک در طول موجی بالای 300nm  رخ دهد.

پراکنش نوری به وسیله پروتیین ها و دیگر ماکرومولکولها در ماتریکس نمونه علت سیگنال های پس زمینه ناخواسته است. نمونه ها لیپمیک پراکنش نوری شدیدی دارند و همکاری آنها در سیگنال فلورسانس پس زمینه در طراحی سنجش های جدید بر پایه فلورسانس باید در نظر گفته شود.

اضافه بر تداخل های پس زمینه ، محلول های رقیق شماری از فلوروفور ها در گستره غلظتی 10^-9 mol / L و کمتر از آن به دیواره کووت های شیشه ای و یا دیگر ظرفهای واکنش میچسبند. همچنین محلولهای رقیق فلوروفورها هنگامی که مدت زمان زیادی تحریک شوند زیر نور شدید تحریک کننده به پدیده photodecomposition حساس میشوند.در عمل این مشکل ها با گزینش درست ظرفهای واکنش ، اضافه کردن عامل های مرطوب کننده (wetting agent)  و کم تر کردن مدت زمانی که نمونه ،نور تحریک کننده را دریافت میکند ، برطرف میشوند.

 

اثر دما (temperature effects)

کارایی فلورسانس کوانتومی بسیاری از مواد در برابر ناپایداری دما حساس هستند.بنابراین دمای واکنش باید بیش از 0.1 درجه سلسیوس تغییر نکند.بطور کلی شدت فلورسانس به ازای یک درجه سلسیوس افزایش دما از 1 تا 5 درصد کاهش پیدا میکند.و نیز کوونچینگ برخوردی (collisional quenching) با افزایش چسبندگی(viscosity)، کاهش پیدا کرده و بنابراین کوونچینگ فلورسانس نیز کاهش پیدا میکند.بنابراین شدت فلورسانس را در عمل با افزایش چسبندگی واکنش یا پایین آوردن دمای حلال افزایش میدهند.

 

Photodecomposition

در فلورومتری معمولی، تحریک محلول های فلورسانس کننده ضعیف یا خیلی رقیق با منبع های نوری شدید سبب تجزیه فوتوشیمیایی آنالیت میشود(photobleaching).گام های زیر در کم کردن اثر photodecomposition کمک کننده است.

1. همیشه بلندترین طول موج ممکن را که پراکنش نوری ایجاد نمیکند را بکار ببرید.
2. مدت زمان تحریک نمونه را با سنجش فوری شدت فلورسانس پس از تحریک ، کوتاه کنید.
3. محلول های ناپایدار را با نگه داری آنها در بطریهای تاریک از نور محیط محافظت کنید.
4. اکسیژن حل شده را از محلول خارج کنید.

اضافه براین ، چشمه های نوری لیزری بسیار شدید با برون ده انرژی بیش از 5 تا 10 mW در فلوسایتومتری ،میکروسکوپی فلورسانس و سنجش های فلورسانس القاشده با لیزر بکار برده میشوند.این چشمه های نوری شدید به سرعت سبب تجزیه نوری (photodecomposition) شماری از آنالیتهای فلورسانس کننده میشود.این تجزیه نوری سبب ایجاد منحنی پاسخ غیر خطی و از دست رفتن بخش زیادی از فلورسانس نمونه میشود.سنجش های بر پایه فلورسانس برای آنالیتهایی که در غلظتهای بسیار پایین انجام میشود نیازمند مناسب سازی (optimization) شدت لیزر و بکارگیری آشکارسازهای حساس میباشد.

 

 

 

منبع:تیتز پایه های شیمی بالینی و تشخیصهای مولکولی،ویرایش پنجم،فصل دهم

 

 

 

,Tietz; textbook of clinical chemistry and molecular diagnostics ,fifth edition,chapter10