طیف سنجی نور (spectrophotometry) - بخش سوم

طیف سنجی نور (spectrophotometry) - بخش سوم

 

 

کالیبراسیون طول موج (wavelength calibration)

در دستگاه های با پهنای باند طیفی باریک ، یک شیشه ای از جنس هولمیوم اکساید (holmium oxide) در طیف 280 nm تا  650 nm اسکن میشود . این ماده قله های جذبی بسیار نوک تیزی در طول موجهایی معین از خود نشان میدهد و کاربر دستگاه میتواند طول موجهایی را که بیشترین جذب را تولید میکنند با مقدار های مشخص شده برای شیشه هولمیوم اکساید مقایسه کند. اگر مقدارهای مقایسه ای بر هم منطبق نباشند یک جدول اصلاح کالیبراسیون را میتوان بازسازی کرد و درجه بندی خوانده شده را با طول موجهای صحیح به هم ارتباط داد. یک منحنی ترانسمیتانس طیفی برای شیشه هولمیوم اکساید در شکل 10-6 نشان داده شده است.

 قله های جذبی انتخابی برای این فیلتر که مناسب است برای منظورهای کالیبراسیون شامل 279.3 ، 418.5 ، 287.6 ، 536.4 ، 333.8 ، 637.5 ، 360.8 نانومتر .محلولهای هولمیوم اکساید در اسید پرکلریک  نیز توصیه شده است.

در دستگاه هایی با پهنای باند وسیع یک فیلتری از جنس دی دایمیوم (didymium) برای تایید طول موج ها استفاده میشود.این فیلتر باید یک درصد حداقلی ترانسمیتانس را در 530 نانومتر در مقایسه با بلانک هوا باید نشان دهد ( شکل 10-7( .

 

پهنای باند طیفی (spectral bandwidth)

پهنای ظاهری یک باند تابشی در نصف ارتفاع قله به عنوان پهنای باند طیفی یک دستگاه در نظر گرفته میشود.پهنای باند طیفی از طریق ویژگی های اعلام شده توسط تولید کننده نیز بدست میاید و یا قابل محاسبه است. فیلترهای تداخلی با پهنای باند 1 تا 2 نانومتر در دسترس هستند و می توان از آنها برای بررسی دستگاه هایی با پهنای باند اسمی 8 نانومتر و بیشتر استفاده کرد.

 

نورهای ناخواسته (stray light)

نورهای ناخواسته به معنای کلی عبارت است از تابش طول موجهایی خارج از باند باریک اسمی عبور یافته توسط تک فام ساز که به اشکار ساز برخورد میکند. یک تک فام ساز کاملا عالی نور را تنها در محدوده پهنای باند خود عبور میدهد و نه خارج طول موجهای خارج از این پهنای باند را . در عمل پراکنش و شکست های نور در درون تک فام ساز نور های با دیگر طول موج ها را در پرتوی خروجی ایجاد میکند. البته این نور توسط دیگر اجزای طیف سنج و نیز توسط خود نمونه اصلاح اصلاح میشود. نورهای ناخواسته معمولا به صورت نسبت یا درصدی از همه نور تشخیص داده شده بیان میشود.

منبع های دیگر نورهای ناخواسته شامل نورهای نفوذ یافته و فلورسانس ناشی از خود نمونه است . از نفوذ نورهای ناخواسته باید با پوشاندن کامل محفظه نمونه جلوگیری شود . نور برخاسته از فلورسانس نمونه سبب افزایش در سیگنال به اشکار ساز شده و در نتیجه باعث یک کاهش ظاهری در میزان جذب را نشان میدهد. این منبع های نورهای ناخواسته در تعریف معمول نورهای ناخواسته گنجانده نمی شوند.

اثر عمده نورهای ناخواسته در کارایی یک طیف سنج ، ایجاد خطا در میزان جذب است به ویژه در انتهای بالایی محدوده جذب دستگاه .بیشتر طیف سنجها با یک یا چند فیلتر نورهای ناخواسته مجهز شده اند. به همین دلیل یک فیلتر آبی با لامپ تانگستن در تنظیم طول موج های زیر 400 نانومتر بکار برده میشود . هنگامی که طیف سنج روی طول موج 350 نانومتر تنظیم میشود بیشتر نورهای ناخواسته طول موجهایی در محدوده نور مریی هستند ، در این لحظه فیلتر آبی بیشتر نورهای مریی را جذب کرده (حذف کرده ) و به خوبی نور فرابنفش را عبور میدهد. به شکلی مشابه ، یک فیلتر قرمز برای طول موجهایی در محدوده 650 تا 800 نانومتر بکار گرفته میشود.

برای شناسایی وجود نورهای ناخواسته فیلترهای کات آف (cutoff filters) بکار برده میشوند . این فیلتر ها همانند فیلترهای نورهای ناخواسته از جنس شیشه هستند و دارای این قابلیت که یک برش نوک تیز در طیف ایجاد میکنند به وسیله قابلیت جذب کامل از یک طرف و ترانسمیتانس بالا از طرف دیگر خود. فیلترهای کات آف مایع نیز مناسب و در محدوده فرابنفش کاربرد آسانی دارند. یک محلول آبی  50 گرم در لیتر از سدیم نیتریت (sodium nitrite) هنگامی که در برابر آب در محدوده 300 تا 385 نانومتر خوانده شود باید  0%T   را نشان دهد. استون نیز هنگامی که در برابر آب در محدوده 250 تا 320 نانومتر خوانده میشود باید 0%T را نشان دهد.

 

صحت فتومتری (photometric accuracy)

فیلترهای چگالی خنثی به عنوان مواد مرجع توسط NIST تهیه و برای بررسی صحت فتومتری دستگاه ها بکار برده میشوند . علاوه بر آن محلول هایی از پتاسیم دی کرومات (K2Cr2O7) را میتوان برای بررسی صحت فتومتری بکار برد. برای مثال محلولهایی ازپتاسیم دی کرومات در 0.005 مولار سولفوریک اسید به شکل های زیر تیه میشود .

محلول A : 0.0500 گرم در لیتر برای محدوده جذب از 0.2 تا 0.7

محلول B : 0.1000 گرم در لیتر برای محدوده جذب از 0.4 تا 1.4

اندازه گیری ها باید در کووت های 10 میلی متری در دمای کنترل شده 15 تا 25 درجه سانتی گراد و با استفاده از اسید سولفوریک 0.005 مولار به عنوان محلول مرجع انجام شوند. جدول 10-4 مقدارهای مورد انتظار برای دو جذب ماکزیمم و مینیمم بر پایه مقدارهای موجود در نوشتار ها را نشان میدهد.

 

از آنجایی که پهنای باند طبیعی محلول A در 350 نانومتر تقریبا 63 نانومتر است مقدار های نشان داده شده فقط در طیف سنجهایی باید بکار برده شود که پهنای باند طیفی آنها 6 نانومتر یا کمتر است.

 

خوانش در چند طول موج(multiple wavelength readings)

تداخل پس زمینه ای (background interference) ناشی از رنگزاهای مداخله گر (interfering substance) را میتوان با استفاده از بلانک (blank) یا با خواندن جذب در دو یا سه طول موج حذف کرد یا کاهش داد. در یک شیوه که بایکروماتیک (bichromatic) خوانده میشود ، جذب در دو طول موج اندازه گیری میشود یکی در طول موجی برابر با قله جذب (peak absorbance) و دیگری در نقطه ای نزدیک به پایه قله (base of the peak) تا به عنوان خط پایه (baseline)عمل کند . اختلاف جذب در دو طول موج متناسب است با غلظت .

در استفاده از این روش دانستن شکل منحنی جذب ماده مورد علاقه و منحنی جذب ماده یا مواد مداخله گر ضروری است .

 

 

منبع:تیتز پایه های شیمی بالینی و تشخیصهای مولکولی،ویرایش پنجم،فصل دهم

,Tietz; textbook of clinical chemistry and  molecular diagnostics ,fifth edition,chapter10