طیف سنجی نور (spectrophotometry) - بخش دوم

طیف سنجی نور (spectrophotometry) - بخش دوم

 

منبع های نور (light sources)

انواع منبع های نور که در طیف سنج ها استفاده میشود شامل لامپهای گدازشی (incandescent lamps) ، لامپهای تخلیه زنون (xenon discharge lamps) ، دیودهای تابنده نور (light emitting diods) ، و لیزر ها (lasers) می باشد.

 

لامپهای گدازشی (incandescent) ، جرقه ای (Arc) و کاتدی (cathode)

در این نوع منبع های نور برای اندازه گیری در بخش نور مریی یک طیف ، معمولا از نور تنگستن (tungsten) استفاده میشود.طول عمر رشته تنگستن در حضور فشار کمی از بخارهای ید یا برم در درون لامپ افزایش می یابد( در حدود 2000 تا 5000 ساعت ).

منبع نور تنگستن انرژی تابشی کافی برای اندازه گیری در محدوده فرابنفش (کمتر از 320 nm ) را نمی تواند تامین کند.در محدوده فرابنفش یا  UV از یک طیف لامپهای هیدروژن یا دوتریوم منبع طیف پیوسته ای از محدوده فرابنفش را با خطوط تابش قوی فراهم میکنند.لامپهای بخار جیوه کم فشار نیز طیفی در محدوده فرابنفش تولید میکنند و برای منظورهای کالیبر کردن مناسب هستند اما برای اندازه گیرهای جذبی مناسب نیستند چون گستره طول موجهایی که تولید میکنند محدود است . لامپهای جیوه ای تابش قوی با طول موج 254 nm را ایجاد میکنند که در اشکارسازهای کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (high performance liquid ghromatography = HPLC) بسیار استفاده میشود. در بعضی از HPLC ها از لامپ کاتدی به عنوان منبع تولید کننده طول موجهای بسیار باریک استفاده میشود.برای مثال یک لامپ کاتدی که از عنصر زینک (روی ) در آن استفاده شده است یک تابشی با طول موج  214 nm را ساطع میکند که خیلی نزدیک به ماکزیمم طول موج ،جذب پیوند پپتیدی (206 nm) است.این ویژگی تابشی اجازه استفاده از چنین لامپهایی را در اندازه گیری پپتیدها و پروتیین ها میدهد.

 

منبع های لیزر (laser sources)

یک لیزر (light amplification by stimulated emission of radiation = laser) یک دستگاهی است که مسیر فوتون های ازاد شده از اتم های پر انرژی را کنترل میکند.لیزرها به عنوان منبع های نور در طیف سنج ها استفاده میشوند چون نورهای با شدت بالا و طول موج هایی باریک تولید میکنند. با استفاده از انتخاب مواد مختلف ، طول موجهای مختلفی از نور توسط انواع مختلفی از لیزرها قابل تولید است (جدول 10-3(.

سه ویژگی منبع های لیزر آنها را از دیگر منبع های رایج متمایز میکند 1- انسجام فضایی از ویژگی های لیزر است که پرتوهای انسجام یافته با قطری به کمی چند میکرون را فراهم میسازد  2- لیزرها نورهای تقریبا تک طول موج (monochromatic light) ایجاد میکنند  3- لیزرها پهنای پالسی دارند که از میکروثانیه (flash lamp –pulsed lasers) تا نانوثانیه (لیزرهای نیتروژن ) تا پیکوثانبه و یا کمتر متغیر است .

 

جدا سازی طیفی (spectral isolation)

انرژی تابشی با یک طول موج خاص را میتوان از دیگر انرژی های تابش دارای طول موجهای ناخواسته به شیوه های مختلف جدا کرد 1-فیلترها (فیلترهای تداخلی یا دایکروییک )  2- منشورها  3-گریتینگ های انکساری . ترکیبی از لنزها و درز ها نیز ممکن است قبل یا بعد از دستگاه منوکروماتور قرار گیرد تا پرتوهای نور را موازی کنند و یا بخش های باریک از پرتو نور را جدا کنند. درزهای متعدد و  متغیری ممکن است برای تعدیل در انرژی تابشی کلی که به فوتو سل میرسد استفاده شود.

 

فیلتر ها (filters)

ساده ترین نوع فیلترها یک لایه نازک از شیشه رنگی است . کمپلکسها یا نمکهای فلزی خاصی که در شیشه حل یا معلق شده اند رنگهایی را تولید میکنند که مطابق با طول موجهای عبوری غالب از آنها است .خلوص طیفی یک فیلتر یا دیگر منوکروماتور ( تک رنگ ساز = تک فام ساز ) ها معمولا به صورت پهنای باند طیفی (spectral bandwidth) بیان میشود . پهنای باند طیفی عبارت است از پهنای منحنی ترانسمیتانس طیفی در نقطه ای برابر با نصف قله ترانسمیتانس ، که بصورت نانومتر بیان میشود.از آنجایی که فیلترهای شیشه ای پهنای باند طیفی نزدیک به 50 nm دارند بنابراین به آنها فیلترهای عبوردهنده باندها با پهنای عریض (wide-bandpass filters) گفته میشود.

فیلتر های شیشه ای دیگر شامل انواع عبور دهنده باند با پهنای باریک (narrow-bandpass) و sharp-cutoff می باشد. از نظر عملکردی فیلترهای نوع cutoff یک افزایش نوک تیز در بخش باریکی از ترانسمیتانس طیف نشان میدهد و به همین دلیل برای حذف نورها با طول موجهای پایین تر و بالاتر از طول موج مورد نظر بکار می روند. از نظر تاریخی فیلترهای نوع narrow-bandpass از ترکیب دو یا چند فیلتر نوع sharp-cutoff یا فیلترهای معمولی ساخته میشدند.

در حال حاضر با وجود منبع های نور با شدت بسیار بالا می توان از مزیتهای فیلترهای تداخلی باند عبوری باریک (narrow-bandpass interference filters) استفاده کرد. این نوع فیلترها از مواد دی الکتریک (dielectric material) با ضخامت کنترل شده استفاده میکنند که بین دو شیشه نقره اندود شده ساندویچ شده است. ضخامت لایه تعیین کننده طول موج انرژی عبوری است. این انرژی عبوری بعد از تداخل های سازنده و مخرب طول موجها ایحاد میشود که نتیجه انعکاسها  بین سطح های شیشه های جدا شده به وسیله فاصله ساز دی الکتریک است.این فیلترها پهنای باند طیفی باریکی دارند معمولا از 5 تا 15 نانومتر.

 

منشورها (prisms) و گریتنگ ها (gratings)

منشورها (prisms)و گریتنیگ های پراکنشی (diffraction gratings) بطور گسترده بعنوان تک فام سازها استفاده میشوند. منشورها نور سفید را به یک طیف پیوسته ای تجزیه و جدا میکنند به این دلیل که در منشور طول موج های کوتاهتر بیشتر از طول موج های بلند تر خم شده یا می شکنند به هنگام عبور از منشور.گریتینگ های پراکنشی از رسوب یک لایه نازک از الیاژ الومینیوم – مس روی یک سطح شیشه ای صاف و سپس خط کشی شیارهای کوچک موازی بیشمار در این فلز پوشاننده ساخته میشوند.بهترین گریتینگ ها دارای 1000 تا 2000 خط موازی در یک میلیمتر هستند و بسیار با دقت باید ساخته شوند.

 

گریتینگ های بسیار پیشرفته با استفاده از لیزر در قالب ماشینهای با دقت بسیار بالا ساخته میشوند. یک پرتو متمرکز از لیزر با صحت بسیار بالا روی یک ماده حساس به نور که فوتورزیست (photoresist) نامیده میشود اسکن میشود . بعد از این که خطوط بیشماری روی فوتو رزیست ایجاد شد با استفاده از مواد شیمیایی خاصی این مواد فوتورزیست حل شده و خارج میشوند و کانالهایی باقی میماند که همان خطوط گریتینگ ها است.یک لایه از ماده بسیار بازتاب کننده روی این سطح با شیارهای حک شده توسط لیزر پوشانده میشود و اکنون گرییتنگ اماده استفاده می باشد.این نوع از گریتنگ ها بی نهایت صحیح عمل میکنند و پراکندگی نوری کمی داشته و در طیف سنج های شیمی بالینی بسیار استفاده میشوند.

هر خط حکاکی شده روی گریتینگ ، هنگامی که نور به آن تابانده میشود ، نور را بصورت طیف های بسیار کوچکی باز میتاباند . یکسری جبهه هایی از موج های موازی شکل گرفته که در آن طول موجهای هم فاز تقویت میشوند و طول موجهای غیر هم فاز از بین میروند، نتیجه خالص این است که یک طیف خطی واحد شکل میگیرد.بعضی از تجهیزات حاوی گریتینگهای پراکنشی هستند که پهنای باند 20 نانومتری یا بیشتر تولید میکنند و بعضی تجهیزات گران قیمت تر دارای قدرت تفکیک 0.5 نانومتر یا کمتر هستند.

 

انتخاب دستگاه جدا کننده طول موج

نوع تک فام سازی که انتخاب میشود بستگی به هدف تجزیه و تحلیل دارد. برای مثال پهنای باند طیفی بسیار باریک برای طیف سنج هایی لازم و ضروری است که برای شناسایی و تفکیک قله های جذبی نوک تیز و نزدیک به هم بکار گرفته میشوند. درست نبودن قانون بییر زمانی رخ میدهد که یک بخش از طیف انرژی عبور کرده از تک فام ساز ، به وسیله ماده جذب کننده نور که قرار است اندازه گیری شود ، جذب نمیشود. این مشکل بیشتر در تجهیزات با پهنای باند وسیع دیده میشود .در عمل افزایش در میزان جذب و بهیود خطی بودن در ارتباط با میزان غلظت معمولا در تجهیزاتی دیده میشود که نورهای با پهنای باند باریک تولید میکنند. این ویژگی در موادی که قله جذبی نوک تیز (sharp peak of absorption) دارند بیشتر دیده میشود.

 

پهنای باند طبیعی (natural bandwidth)

پهنای باند طبیعی برای یک ماده جذب کننده نور عبارت است از پهنای باندی از منحنی جذبی طیفی (spectral absorbance curve) آن ماده در نقطه ای برابر با نصف ماکزیمم جذب . به عنوان یک قانون کلی پهنای باند طیفی نباید از 10% میزان پنای باند طبیعی تجاوز کند در غیر این صورت میزان صحت اندازه گیری 99.5 % نخواهد بود . برای مثال در بسیاری از روشهای شیمی مواد جذب کننده نور تولید میشوند که پهنای باند طبیعی از 40 نانومتر تا 200 نانومتر متغیر است . به عنوان مثالی دیگر پهنای باند طبیعی NADH برابر با 58 نانومتر (λmax = 339 nm) است بنابراین برای اندازه گیری صحیح این ماده باید پهنای باند طیفی 6 نانومتر و یا کمتر باشد.

در عمل طول موج معمولا برابر با مقدار معادل در قله ماکزیمم جذب انتخاب میشود تا بیشترین جذب به دست اید. با این حال گاهی موارد منطقی است که یک طول موج دیگری را انتخاب کرد تا دخالت مواد مداخله گر را به کم ترین مقدار رساند. برای مثال کدورت سنجی در محدوده آبی جذب بیشتری تولید میکند تا در محدوده قرمز اما محدوده قرمز برای کدورت سنجی انتخاب میشود تا از جذب نور به وسیله بیلیروبین (460 nm) یا هموگلوبین (417nm) جلوگیری شود. مواد جذب کننده نور که در روش پیکرات قلیایی در اندازه گیری کراتینین تولید میشوند یک قله نسبتا پهنی در محدوده نور مریی و در طول موج 480 نانومتر ایجاد میکنند اما در این محدوده یعنی زیر 500 نانومتر ، ریاجنت بلانک نیز جذب خیلی قوی دارد و به همین خاطر اندازه گیری کراتینین در این طول موج دشوار و غیر ممکن است. اما در طول موج 520 نانومتر ریاجنت بلانک برخلاف کراتینین دیگر جذب قابل توجهی ندارد و اندازه گیری مقدور میشود . بنابراین باید جذب ریاجنت بلانک باید همیشه در پایین ترین مقدار نگه داشته شود تا میزان دقت و صحت روش اندازه گیری بهبود یابد. محدوده خطی بودن یک روش اندازه گیری بر مبنای جذب نور را میتوان با اندازه گیری در طولی موجی غیر از طول موج ماکزیمم جذب ، انجام و توسعه داد . در هر حال به این نکته باید همیشه توجه داشت که اندازه گیری ها نباید در محدوده هایی با شیب تند از منحنی جذب یک ماده انجام شود چون یک خطای نوری در تنظیم طول موج منجر به خطای قابل توجه در خوانش جذب میشود.

 

اشکار سازهای نور (photodetectors)

یک فوتو دیتکتور دستگاهی است که نور را به جریان الکتریکی تبدیل میکند که میزان این جریان الکتریکی متناسب با تعداد فوتون هایی است سطح حساس به نور را تحریک کرده است .لوله تکثیر کننده نور (photomultiplier tube) یک دستگاه معمول و رایج به عنوان فوتو دیتکتور است برای اندازه گیری شدت نور در محدوده های فرابنفش و مریی از طیف . به عنوان گزینه ای دیگر ، فوتو دایود ها نیز دستگاههای حالت جامدی هستند که در دستگاههای پیشرفته استفاده میشوند.

 

لوله های تکثیر کننده نور (photomultiplier tubes)

یک فتومولتی پلایر حاوی 1- کاتد  2- فلز حساس به نور  3- یک سری داینود (dynodes)  که همه اینها در یک محفظه شیشه ای خلا جای گرفته اند .در فتومولتی پلایرها بطور معمول 10 تا 15 مرحله یا داینود وجود دارد. فوتون هایی که به کاتد تابنده فوتون(photoemissive cathode) برخورد میکنند ، موجب تابش الکترونهایی میشوند که به سمت داینود ها شتاب یافته اند . الکترونهای اضافه تری در هر داینود تولید میشود . بسته به تعداد داینود ها و ولتاژ شتاب دهنده ، اثر ابشاری ایجاد شده سبب تولید 10^5  تا  10^7  الکترون به ازای یک فوتون برخورد کننده به کاتد اول میشود .این سیگنال تکثیر شده در نهایت در آند جمع اوری و اندازه گیری میشود.

هنگام کار فتومولتی پلایر ولتاژی بین فوتوکاتد و هر یک از مراحل پی در پی یا همان داینود ها برقرار میشود .افزاش پله ای در ولتاژ در هر مرحله از فتومولتی پلایر نسبت به مرحله قبلی خود از 50 تا 100 ولت متغیر است ( شکل 10 – 5(  . بطور معمول ذر یک فتومولتی پلایر 1500 ولت اختلاف پتانسیل برقرار میشود.

 

فتومولتی پلایر ها 1- زمان پاسخ بینهایت سریعی دارند  2- خیلی حساس هستند  3- خیلی دیر فرسوده میشوند. چون این لوله ها خیلی حساس هستند و سریع پاسخ میدهند بنابراین باید در برابر نورهای ناخواسته خیلی به دقت عایق بندی شوند.

بدلیل ولتاژی که در فتومولتی  پلایر اعمال میشود اگر در معرض نور اتاق قرار گیرند میسوزند و از کار می افتند. هنگامی که ولتاژ در یک فتومولتی  پلایر برقرار میشود  در حالی که نور برخوردی وجود ندارد ، مقداری جریان بطور معمول تولید میشود که به آن جریان تاریک گفته میشود . در یک فتومولتی  پلایر خوب باید این جریان تاریک به کمترین مقدار ممکن باید برسد چون این جریان تاریک به عنوان نویز پس زمینه (background noise) مشاهده میشود.

 

فوتو دایود ها (photodiodes)

فوتو دایود ها فوتو دیتکتورهای حالت جامدی هستند که از مواد نیمه هادی حساس به نور ساخته شده اند موادی مانند  1- سیلیکون(silicon)  2- گالیوم ارسناید(gallium arsenide)  3- ایندیوم انتی موناید(indium antimonide)  4- ایندیوم ارسناید(indium arsenide)  5- لید سلناید(lead selenide)  6- لید سولفاید(lead sulfide) . این مواد نور را در طیف خاصی از طول موجها جذب میکنند (برای مثال ، 250 nm  تا  1100 nm برای سیلیکون ) . با استفاده از این دیتکتورها می توان نور را در بسیاری از طول موجها اندازه گیری کرد. هنگامی که یک فوتو دیتکتور از دو سری دایود در دو بعد تشکیل شده باشد این نوع فوتو دایود ها را فوتو دایود اری (photodiode array) می نامند. هر فوتو دیتکتور در داخل فوتو دایود اری به یک طول موج خاصی پاسخ میدهد . برای مثال فوتو دایود اری هایی طراحی شده اند تا یک قدرت تفکیک (resolution) ،  2 nm به ازای هر دایود در طیف 200 nm تا  340 nm داشته باشند و نیز انواعی دیگر که قدرت تفکیک  1 nm  به ازای هر فوتودایود از  340 nm تا 800 nm را دارند.

 

در عمل تمام فوتودایود ها در ابتدا تا میزان 5 V شارژ (پر شدن از بار الکتریکی ) میشوند و هنگامی که نور به این دایودها برخورد میکند دیس شارژ  (تخلیه شدن از بار الکتریکی ) میشوند . سپس هر دایود به پشت سر هم اسکن میشوند و دوباره تا مقدار 5 V  دوباره شارژ میشوند . مقدار انرژی لازم برای شارژ دوباره این فوتودایود ها متناسب است با مقدار نور برخوردی به  این فوتودایودها .  از آنجایی که زمان اسکن کردن برای تمام دایودها در هزارم ثانیه انجام میشود پس تعداد اسکنهای بسیار زیادی انجام میشود. داده های بدست امده از این اسکن ها با استفاده از تعدادی الگوریتم شامل میانگیری از سیگنالها ، کسر کردن پس زمینه ها ، و اصلاح نورهای پراکنده شده میباشد. در نهایت نتیجه به این صورت نمایش داده میشود که یک طیف نوری از واکنش شیمیایی در حال رخ دادن به صورت تابعی از زمان با یک درجه بالایی از تفکیک و صحت در مانیتور نمایش داده میشود.

 

پارامترهای کارایی (performance parameters)

در بسیاری از روشهای انالیز طیف سنجی ، جذب یک مقدار مجهول بطور مستقیم با یک کالیبراتور یا یک سری کالیبراتور مقایسه میشود. تحت این شرایط ، خطای خیلی کم در کالیبراسیون طول موج ، تغییرات در پهنای باند طیفی و وجود نورهای ناخواسته (stray light) جبران شده و خطاهای جدی را در اندازه گیری سبب نمی شوند.  در مواقعی که محاسبه ها در مورد جذب مولی یا ضریب های جذب بر پایه مقدار های تعیین شده از قبل و منتشر شده در نوشتارهای علمی است در این صورت طیف سنج باید بسیار شدید مورد بررسی قرار گیرد. همچنین تایید کارایی طیف سنج ها به شکل دوره ای میزان اعتماد به تحلیل های مقایسه ای را افزایش و بهبود می بخشد.

برای تایید این که یک طیف سنج به شکل رضایت بخشی کار میکند باید نشان داده شود که طیف سنج قادر است در محدوده ویژگی های دستگاهی خود عمل میکند. این پارامترها شامل  1- صحت طول موج (wavelength accuracy)  2- پهنای باند طیفی (spectral bandwidth) 3- نور های ناخواسته (stray light) 4- خطی بودن (linearity)   5-صحت فتومتری (photometric accuracy)

موسسه ملی استانداردها و فن اوری های امریکا  (NIST) چند ماده مرجع استاندارد را برای طیف سنجی تهیه کرده است که برای تایید کارایی فوتومترهای یا طیف سنج ها مفید است ( www.nist.gov) . موسسه مواد مرجع و اندازه گیری ها (IRMM) که متعلق به کمیسیونی اروپایی است نیز مواد مرجعی را برای تایید کارایی فوتومترها یا طیف سنج ها تهیه کرده است.(www.irmm.jrc.be).

 

 

منبع:تیتز پایه های شیمی بالینی و تشخیصهای مولکولی،ویرایش پنجم،فصل دهم

,Tietz; textbook of clinical chemistry and  molecular diagnostics ,fifth edition,chapter10