مقدمه ای بر الایزا
کتاب راهنمای الایزا
مقدمه
پیشرفتهای زیادی نبوده طوری که لازم به ویرایش وسیع در نسخه قبلی این کتاب لازم باشد.از این حقیقت ناشی میشود که سنجش های هتروژن مبتنی بر مولکولهای ایمنی متصل به انزیم (enzyme linked immunosorbent assay=ELISA) سیستم هایی بسیار عالی را در مطالعه طیف وسیعی از حوزه های بیولوژیکی فراهم میکند.اصلی ترین علت این موفقیت انعطاف پذیری تست است طوری که واکنشگرها میتوانند به شیوه های ترکیبی مختلف ، یا چسبیده بصورت غیرفعال (passive) به پایه فاز جامد و یا بصورت ازاد در فاز مایع مورد استفاده قرار گیرند.بهره گیری از الایزا همچنان از طریق پیشرفت مداوم ریاجنتهای تولید شده کاملا اختصاصی در حال افزایش بوده است ، به عنوان مثال انتی بادی های منوکلونال و پلی کلونال و انتی ژن های پپتیدی درکنار پیشرفت و توسعه تولیدات تجاری مانند کنژوگه های متصل به انزیم ، سوبستراها ، و رنگزا ها ، تکنولوژی پلاستیک و طراحی پلیتهای دارای چاهکهای کوچک ، پیشرفتهای دستگاهی و روبوتها . با این حال اصول الایزا همچنان ثابت باقی مانده است .کمی بازارایی فصل ها وجود داشته است بعلاوه اضافه کردن سه فصل جدید که به روش های رسم منحنی برای ارزیابی الایزای غیر مستقیم ، جنبه های مقاومت و توانمندی کاربری کیت و اعتبارسنجی آن و مدیریت داده های مربوط به کنترل کیفی داخلی و کنترل کیفی خارجی به ترتیب می پردازد. همه این ها انعکاس دهنده نیاز به کنترل آنچه که با الایزا انجام میدهید می باشد و نیز به منظور بهره گیری از این متد با تمام توانمندی اش.من بخاطر پرداختن چند باره به حوزه های یکسان به شیوه های متفاوت عذرخواهی نمیکنم ، چون لازم است که اصول الایزا کاملا درک شود تا بتوان الایزا را طراحی کرد، با آن کار کرد و کنترل کرد.
یک بررسی مختصر در نوشتارهای شامل الایزا نشان از موفقیت مداوم الایزا دارد.شمار انتشاراتی که که الایزا در آن ذکر شده است در تمام حوزه های علوم از سال 1976 تا 2004 در جدول 1 نشان داده شده است .یک افزایش نسبتا ثابتی در شمار تحقیقاتی که از متدهای الایزا استفاده کرده اند قابل مشاهده است . یک ارایه تفکیکی از نشریات با توجه به حوزه های دانش بصورت دوره های 5 ساله از سال 1980 در جدول 2 نمایش داده شده است که کاربردی بودن الایزا را مشخص میکند علاوه بر اینکه نشان میدهد که عمده ترین حوزه ها استفاده در پزشکی و دندانپزشکی ، ایمونولوژی و میکروبیولوژیکی ، بیولوژی مولکولی و ژنتیک و بیوتکنولوژی است.جالب است که یاداور شویم که استفاده اولیه از الایزا در ایمونولوژی و میکروبیولوژی و بیولوژی مولکولی و بیوتکنولوژی بوده است که احتمالا منعکس کننده بزرگترین حوزه های تحقیقات است .پزشکی و دندانپزشکی بیشترین میزان افزایش در استفاده از الایزا از سال 1990 نشان میدهد(احتمالا تنهای در حوزه پزشکی ).
نتایج جستجوها نشان دهنده توسعه مداوم الایزا درعلم است و دلیلی وجود ندارد که گمان کنیم که این متد تغییرخواهد کرد حتی با وجود فن اوری های جدید که روش های مولکولی را مورد استفاده قرار میدهند.
ویژگی های تحلیلی و نظام مند الایزا آنرا جهت تشخیص در سطح غربالگری ، به منظور نظارت درمواردی که بررسی نمونه ها در مقیاسی بزرگ لازم است و برای تحقیقات ، بسیار خوب مناسب ساخته است.بسیاری از سنجش های استاندارد مورد قبول در بسیاری از حوزه های دانش مبتنی بر الایزا هستند و جایگزین سنجش های استاندارد طلایی دیگر شده است . در همراهی با استفاده از روشهای مولکولی که بسرعت در حال تکامل هستند با تمرکز بر فن اوری های واکنش زنجیری پلیمراز (PCR) ، همچنان به استفاده از روشهای تاییدی سرولوژیک بصورت شیوه ای دوتایی در شناسایی مستقیم و تعیین خصوصیت بیماری نیازمی باشد و نیز،نیازبه ارزیابی میزان شیوع بیماری از طریق اندازه گیری انتی بادی های خاص یا دیگر عوامل شیمیایی حاصل از عفونت همچنان وجود دارد.استفاده از متدهای الایزا در ازمایش کردن محیط و محصولات حیوانات و گیاهان از این نظر که برای مصرف حیوانات و انسان ایمن باشند نیز یک حوزه به سرعت در حال رشد برای الایزا است.
بنابراین الایزادر تمام زمینه های کاربردی و محض بیولوژی مورد استفاده قرارگرفته است .به ویژه که اسکلت تکنیک های تشخیصی را تشکیل میدهد.سیستم هایی که ازالایزا استفاده میکنند در واقع از انتی بادی ها بهره میگیرند.انتی بادی ها پروتیین هایی هستند که در حیوانات در پاسخ به تحریک های انتی ژنی تولید میشوند.انتی بادی ها مواد شیمیایی خاصی هستند که به انتی ژنها متصل میشوند ، همان آنتی ژنهایی که برای تولید آنها استفاده شده اند ، بنابراین از آنها می توان در تشخیص انتی ژنهای خاصی بهره جست اگر اتصال به انتی ژن به نحوی اثبات شود.بر عکس ، انتی بادی هایی خاص میتوانند به وسیله انتی ژنهایی معین و تعریف شده اندازه گیری شوند و این پایه بسیاری ازسنجش ها را در بیولوژی تشخیصی شکل میدهد.
کتاب به توصیف روشهای الایزا می پردازد ، مثلا یک جایی یکی از ریاجنتها که معمولا یک انتی بادی است به یک انزیم متصل میشود و یک جایی دیگر یک ریاجنت به فاز جامد چسبانده میشود . این سیستم ها بررسی واکنش ها را از طریق اضافه کردن و اینکوباسیون ریاجنتها میسر میسازد.وکنشگرهای متصل شده و واکنشگرهای ازاد به وسیله شستشو از هم جدا میشوند.محصول نهایی در الایزا تشکیل رنگ است که با استفاده از یک اسپکتروفتومتر تعیین مقدار میشود.این نوع از الایزا سنجش های هتروژن نامیده میشوند و باید از سنجشهای هموژن که در آن تمام ریاجنت ها همزمان اضافه میشوند افتراق باید داده شود.این سنجشهای اخیر بیشتر مناسب تشخیص مولکولهای کوچک نظیر دیگوکسین یا جنتا مایسین است.
توسعه الایزا از بررسی های انتی بادی های نشاندار شده با انزیم (3-1) برای تشخیص انتی ژنها در بافت ریشه گرفت.روش های کنژوگاسیون برای اندازه گیری اجزای سرم در اولین الایزا های واقعی (6-4) مورد بهره برداری قرار گرفت.و خیلی بیشتر (7) . چنین سیستم هایی از تجهیزات اختصاصی تجاری شده وسیعی مانند پی پتهای چند کاناله برای توزیع اسان همزمان ریاجنتها و اسپکتروفتومترهای چند کاناله برای اخذ سریع داده ها بهره مند هستند.کتابها و دست نوشته ها و مرور های زیادی در مورد الایزا و موضوعات مرتبط وجود دارد که در جزییات عملی باید مورد ارزیابی قرار گیرند (21-8).
هدف ازتوسعه الایزا حل مشکلات است .این مشکلات به دو دسته کاربردهای محض و کاربردی تقسیم میشوند، اگر چه این دو به هم وابسته هستند.بنابراین یک ازمایشگاه با یک پایه تحقیقاتی قوی لازم و ضروری است که بینشهای علمی و ریاجنتهای ارزشمندی را برای کاربری های معمول خود فراهم اورد.این روشها انعطاف پذیری این سیستم ها را نشان میدهد.کاربرد موثر این ها وابسته به میزان خلاقیت و نواوری دانشمندان است.پیشرفتهای اخیر در دانش به دانشمندان حوزه ایمونواسی توانایی بیشتری در بهبود بخشیدن میزان حساسیت و اختصاصیت سنجشها به شمول الایزا داده است .بطور ویژه توسعه تکنولوژی انتی بادی منوکلونال به ما ریاجنتهای شیمیایی منحصر به فردی (انتی بادی ها ) با اختصاصیت معینی را داده است که قابل استاندارد شدن به صورت میزان فعالیت به ازای وزن آنها است.
توسعه سیستم های بیان ژن نیز امکان بیان ژن های منفرد را بصورت پروتیین برای تولید انتی بادی ها و یا انتی ژنهای خالص فراهم کرده است.این فن اوری همینطور دست به دست میرود و با توسعه در فن اوری های PCR همراه است به شکلی که شناسایی سریع ژنها و دستکاری آنها را برای ما مقدور میسازد. درعوض ، پیشرفت ها در زمینه های تعیین توالی سریع و روشهای کریستالوگرافی با تابش X منجر به فهم عمیق تر ارتباط ساختار – عملکرد موجودات در حوزه ایمونولوژی بیماری شده است .الایزا در این پیشرفتها خوب عمل میکند ، چرا که سنجشی مبتنی بر اتصال انتی بادی ها و انتی ژنهای معین است که هر کدام از آنها قابل تهیه هستند.جدول 3 بعضی از کاربردهای الایزا را با مرجع های مربوط نشان می دهد.
توانایی در توسعه الایزا وابسته به فهم عمیق تر دانشهای ایمونولوژی / سرولوژی / و بیوشیمیایی سیستم های بیولوژیکی خاص است.چنین اطلاعاتی هم اکنون با رجوع در نوشتارها موجود است.مهارتهای پایه در روشهای ایمونوشیمی نیز یک نیازمهم است و دست نوشته هایی عالی برای این منظور در دسترس است (90) . رفرانس های (92و91) کتابهایی بسیار عالی در مورد ایمونولوژی هستند.یک منبع بسیار با ارزش از ریاجنتهای ایمونولوژی تجاری شده در مرجع (69) موجود است.مرجع های 70 به بعد تازه تر هستند و زمینه های جدیدتری هستند که الایزا درآن حوزه ها توسعه یافته است و نیز مشکلات جدیدی که از آن برخاسته است به عنوان مثال انفلوانزای پرندگان و SARS . سخت است که ببینیم که در میزان استفاده از الایزا کاهش قابل ملاحظه ای باشد چه بطور مستقیم و چه بصورت بخشی از یک دیگر سیستم های مولکولی ، اما این چیزی است که در چاپ ویرایش جدید این کتاب قابل بررسی خواهد بود.خطر عمده روشهایی به شمول الایزا هستند که هم اکنون به اسانی در حال توسعه هستند.همانند سایر ازمایش ها چنین چیزی صادق نیست و اموزش در الایزا امروزه خیلی مهم است ، چرا که طیف قابل توجهی از ریاجنتها به منظور توسعه ازمایش ها موجود است .ارتباط روشهای مولکولی به الایزا و دیگر سیستم های تشخیصی مبتنی بر سنجشهای فاز جامد هیجان انگیز و پرظرفیت است اما همچنان نیاز به فهم پایه ای اصول الایزا وجود دارد.
John R . Crowther
اتریش، وین
فهرست
مقدمه
- مرور الایزا در ارتباط با دیگر حوزه ها
- سیستم های الایزا
- مراحل الایزا
- تیتراسیون ریاجنتها
- ملاحظات تئوری
- تمرین های عملی
- انتی بادی های منوکلونال
- اعتبار سنجی ازمایش های تشخیصی بیماریهای عفونی
- روشهای رسم منحنی کنترل کیفی داخلی برای الایزای رقابتی
- روشهای رسم منحنی کنترل کیفی داخلی برای الایزای غیر مستقیم
- پایداری ازمایش ها : جنبهای کاربری و اعتباری کیت
- روشهای اماری پیشرفته برای تضمین کیفیت ، اعتبار سنجی ازمایش ها و تفسیر
- مدیریت داده های کنترل کیفی داخلی و کنترل کیفی خارجی درعمل
- تکنیک های ایمونوشیمی
