کروماتوگرافی (chromatography)-بخش دوم
Elctron capture detector.اساس عملکرد ECD برپایه واکنش بین ترکیب های الکترونگاتیو (electronegative compound) و الکترون های گرمایی (thermal electron) است.الکترون ها بطور طبیعی از یک سرچشمه رادیواکتیو مانند 63Ni یا 3H که در آشکارساز جاگذاری شده است فراهم میگردد.یک الکترود گرداوری کننده ضربان دار شده (pulsed) تا الکترون های مازاد را جمع اوری کند.این فرایند یک جریان مانا (standing current) ایجاد میکند.اگر گونه های الکترونگاتیو در سلول آشکارساز وجود نداشته باشد گازهای جاروکننده (sweep gas) نیتروژن و یا مخلوط آرگون / متان بیشتر الکترون ها را از سلول برمیدارند.هنگامی که یک ترکیب توانایی گرفتن یک الکترون را دارد و از سلول میگذرد، برخی از الکترون ها گرفته شده و یک کاهش در جریان مانا دیده میشود.استفاده از نیتروژن یا مخلوط ارگون / متان مهم است چون این گازها انرژی الکترون ها را از طریق برخورد کاهش داده و توانایی ترکیب ها را برای گرفتن آنها بهبود میبخشند.در برخی از آشکارسازها میزان پالس گرداوری تغییر میکند تا یک مقدار جریان ثابتی ایجاد گردد.آنگاه این پالس ها شمارش میشوند و از این شمارش ها برای تعیین غلظت گونه های الکترونگاتیو که از سلول میگذرند استفاده میشود.ECD یک آشکارساز وابسته به غلظت است .وجود ترکیب های الکترونگاتیو مانند فلوئورین (fluorine) ، کلرین (chlorine) ، برومین (bromine) ، و آیودین (iodine) پاسخ آشکارساز را افزایش میدهد.از آنجایی که همه ترکیب ها این گروه های عملکردی را ندارند مشتق سازی (derivatization) با ریاجنتهایی که دارای گروه های پلی کلرینه یا پلی فلوئورینه هستند برای افزایش پاسخ آشکارساز یک روند معمول است.
Photoionization detector
این آشکارساز یک گونه ای از FID است. در این آشکارساز انرژی برای یونیزاسیون بجای شعله ، به وسیله یک لامپ UV شدید فراهم میگردد.
Thermal conductivity detector
اساس این آشکارساز بر این اصل استوار است که افزودن یک ترکیب به گاز سبب تغییر هدایت گرمایی (thermal conductance) گاز میگردد.
Mass spectrometer
اسپکترومترهای جرمی نیز به عنوان آشکارسازها در گازکروماتوگراف ها بکار برده میشوند.
آنالیز کیفی و کمی (qualitative and quantitative analysis)
از کروماتوگرافی برای شناسایی کیفی و اندازه گیری انالیت های مورد نظر استفاده میشود.
شناسایی انالیت (Analyte identification)
زمان نگه داشت یا حجمی که یک حل شونده مجهول از ستون خارج میشود و یا فاصله ای را که در یک صفحه می پیماید با همان ویژگی های یک ترکیب مرجع مقایسه و ارتباط داده میشود.ظاهر یک پیک ، باند یا نقطه ماده حل شونده در یک زمان(time) ،حجم(volume) یا فاصله(distance) مربوظ به یک ترکیب مرجع با یکسان بودن این دو ترکیب سازگار است.این ظاهر همزمان هویت را ثابت نمیکند چون ترکیب های دیگری همان زمان نگه داشت یا حجم را داشته و یا میتوانند همان فاصله ای را که ترکیب مرجع پیموده است را بپیمایند.
در کروماتوگرافی صفحه ای ترکیب های مرجع با نمونه های مجهول کروماتوگرافی میشوند.شناسایی آزمایشی با مقایسه فاصله مهاجرت و ویژگی های تشخیصی ترکیب های مرجع با همان ویژگی های انالیت مجهول انجام میگیرد.اگر Rf انالیت مجهول و Rf ترکیب مجهول با هم یکسان نباشند نمونه مجهول به عنوان یک نمونه متفاوت شناسایی میشود.اگر این ویژگی ها یکسان باشند آنگاه نمونه مجهول ترکیبی یکسان با ترکیب مرجع در نظر گرفته میشود.با این حال به دلیل اینکه بیش از یک ترکیب میتواند در یک سیستم کروماتوگرافی دارای Rf یکسان باشند تشخیص فرضی باید به وسیله ریاجنت های افشانه ای اختصاصی، تشکیل کمپلکس با آنتی بادی یا جداسازی ترکیب و به دنبال آن آنالیز شیمیایی و یا دستگاهی تایید شود.هم اکنون نرم افزارهایی در دسترس هستند که شناسایی ترکیب را با کمک جستجوی طیف UV بر پایه مقادیر Rf انجام میدهند.
با GC مویین و ستون های LC اجزای یک نمونه را میتوان همزمان به دو ستون که دارای فازهای ثابت ناهمانند هستند تزریق کرد.این ستون ها میتوانند دارای آشکارساز از یک نوع و یا از انواع متفاوت باشند.تطابق ویژگی های نگه داشت یک انالیت یکتا یا یک ترکیب مرجع (reference compound) بر روی دو ستون با فازهای ناهمسان شانس شناسایی درست انالیت را افزایش میدهد.قابل اعتماد ترین شناسایی به وسیله آشکارسازی فراهم میشود که اطلاعات ساختاری ترکیب را میدهد مانند یک اسپکترومتر جرمی .
اندازه گیری انالیت (analyte quantification)
سیگنال های الکترونیک که از آشکارساز(ها) می آیند داده هایی را برای اندازه گیری انالیت فراهم میکنند.تکنیک های کالیبرکردن داخلی (internal) و خارجی (external) استفاده میشوند.در تکنیک کالیبرکردن خارجی ،محلولهای مرجع که دارای مقدارهای معلوم از انالیت هستند به همان شیوه هایی که نمونه دارای انالیت پردازش میشود ، پردازش میگردند(شکل 13-14).
یک منحنی کالیبراسیون از (1) ارتفاع پیک(peak height) ،(2) سطح پیک(peak area)، یا (3) تراکم نقطه (spot density)، در برابر غلظت کالیبراتور ساخته میشود تا غلظت انالیت در نمونه ها محاسبه شود.در تکنیک کالیبراسیون داخلی،یک مقدار ثابت از یک ترکیب متفاوت با ترکیب مرجع و انالیت(internal standard)، هم به محلول مرجع با غلظت معلوم از انالیت و هم به نمونه دارای انالیت با غلظت نامعلوم اضافه میگردد.(شکل 13-15).
با رسم نسبت ارتفاع پیک (یا سطح) یا تراکم نقطه انالیت به ارتفاع پیک (یا سطح) یا تراکم نقطه استاندارد داخلی در برابر غلظت آنالیت یک منحنی کالیبراسیون به دست می آید که از دست رفت های سیستماتیک (systematic losses) را اصلاح میکند.از این منحنی سپس برای بدست آوردن غلظت انالیت در نمونه ها استفاده میشود.
استخراج و پرسیپیتاسیون افتراقی (extraction and differential precipitation)
استخراج و پرسیپیتاسیون افتراقی به جداسازی اجزا به بخش های مشخص گفته میشود که بیشتر شامل دو بخش مایع مشخص و یا یک بخش مایع و یک بخش جامد میشود که ممکن است به وسیله سانتریفوژ یا فیلتراسیون از هم جدا شوند.در این تکنیک اجزای مختلف در دو فاز جدا میشوند که سپس بطور فیزیکی از هم جدا میشوند.استخراج و پرسیپیتاسیون افتراقی بیشتر برای ساده سازی نمونه ها و برداشت اجزایی مانند پروتیین ها بکار میرود که ممکن است در روشهای کروماتوگرافی و انالایتیکال بعدی تداخل کنند.استخراج ممکن است به عنوان روشی برای غلیظ کردن نمونه ها استفاده شود همچون استخراج با حلالهای آلی فرار و به دنبال آن تبخیر حلال بخش استخراج شده (extract) را به دست میدهد که غلظت بالاتری نسبت به نمونه اصلی دارد.پرسیپیتاسیون افتراقی از وضعیتهایی بهره میگیرد که به آن وسیله برخی اجزا محلول بوده در حالی که دیگر اجزا رسوب (precipitation) میکنند.از رسوب پروتیین ها به وسیله اسید یا حلال های آلی برای جداسازی آنها در مایع های زیستی از داروها و دیگر مولکولهای کوچک استفاده میشود.از دیگر نمونه ها میتوان رسوب افتراقی البومین و گلوبولین ها با محلول های نمکی و جداسازی بخش های لیپوپروتیینی به وسیله عامل های رسوب دهنده انتخابگر را نام برد.
استفاده از استخراج فاز جامد در بسیاری از کاربردها رو به افزایش یوده است و فازهای جامد در قالبهای گوناگون شامل ستونهای باز کوچک ، کارتریج ها ، و پلیتهای 96 چاهک فشرده سازی (packed) میشوند.بکارگیری ذرات روزنه دار با اندازه روزنه کمتر از 10 nm سبب پس زدن پروتیین ها از روزنه ها شده و منجر به حذف پروتیین ها میشود.بطور کلی استخراج با فاز جامد(جامد – مایع ) یک استخراج انتخابی تری را نسبت به استخراج مایع – مایع ارایه میدهد چون در استخراج فاز جامد امکان انجام مراحل شستشو پیش از خارج کردن اجزای مورد نظر با حلالهای مشخص وجود دارد.استخراج فاز جامد آسان تر خودکار (automated) میشود و میتوان از آن به شکل استخراج بر خط (online) به عنوان یک گام جداسازی اولیه در یک فرایند کروماتوگرافی استفاده کرد.استفاده از استخراج برخط و متصل به یک جداسازی کروماتوگرافی مایع ،خودکارسازی و تکرارپذیری کار با نمونه ها را بهبود می بخشد.
منبع:تیتز پایه های شیمی بالینی و تشخیصهای مولکولی،ویرایش پنجم،فصل سیزدهم
,Tietz; textbook of clinical chemistry and molecular diagnostics ,fifth edition,chapter13
