انزیم و انالیز سرعت (Enzyme and rate analyses) - بخش اول

فصل 15

 

انزیم و آنالیز سرعت (enzyme and rate analyses)

 

انزیم ها پروتیین هایی هستند با ویژگی های کاتالایتیک، انزیم شناسی بالینی استفاده از دانش انزیم ها در تشخیص و درمان بیماری ها است.اصول انزیم شناسی بالینی در این فصل ارایه و بحث خواهد شد.همچنین اطلاعاتی مبنی بر چگونگی اندازه گیری انزیم ها و اینکه چگونه آنها به عنوان ریاجنتهای انالایتیکال در انواع مختلفی از انالیز سرعت استفاده میشود.بخش ها شامل اصول پایه ،کینتیک انزیم ها و انزیم شناسی انالایتیکال و انالیز سرعت میباشد.

 

اصول پایه (basic principles)

این بخش با شیوه نام گذاری انزیم ها شروع میشود و به دنبال آن انزیم ها بعنوان پروتیین ها و کاتالیست ها مورد بحث قرار میگیرند.

شیوه نام گذاری انزیم ها (enzyme nomenclature)

از نظر تاریخی انزیم ها با استفاده از نام سوبسترا یا گروهی که آنها روی آن عمل میکنند و سپس افزودن پسوند   -ase نامگذاری میشدند.برای نمونه انزیم هیدرولیز کننده اوره را اوره از (urease) مینامیدند.بعدها نوع واکنش انزیمی نیز شناسایی شد مانند کربنیک انیدراز، D-امینواسیداکسیداز و سوکسینات دهیدروژناز. اضافه بر این برخی انزیم ها نام های تجربی داده شده اند مانند تریپسین ، دیاستاز، پتیالین،پپسین و ایمالسین.

از آنجایی که این نام های معمول کوتاه ناکارامد به نظر میرسیدند در سال 1995 اتحادیه بین المللی بیوشیمی (IUB) یک کمیسیون انزیم (enzyme commission = EC) برای مطالعه و حل مشکل نام گذاری انزیم ها به وجود آورد.پیشنهاد این کمیسیون یک پایه منطقی و عملی را برای شناسایی همه انزیم های تاکنون شناخته شده و نیز انزیم هایی که در آینده شناخته خواهند شد فراهم میکند.

در سیستم IUB یک نام سیستماتیک و نام کوتاه برای هر انزیم در نظر گرفته میشود.نام سیستماتیک ماهیت واکنش کاتالیز شده را بازگو میکند و همراه با یک کد عددی یکتا است.نام کوتاه یا عملی که ممکن است یکسان با نام سیستماتیک باشد اما اغلب شکل ساده شده آن است برای استفاده روزانه مناسب است.نام گذاری عددی یکتا برای هر انزیم متشکل از چهار شماره که یا نقظه از هم جدا شده اند (مانند 2.2.8.11( و با حروف EC در پیش آن نام گذاری میشوند.اولین شماره کلاسی را که انزیم به آن تعلق دارد تعریف میکند.همه انزیم ها در شش کلاس دسته بندی میشوند که با نوع واکنشی که کاتالیز میکنند بیان مشوند 1) اکسیدوردوکتاز( oxidoreductases) ، 2) ترانسفراز (transferases) ، 3) هیدرولاز (hydrolases)، 4) لیاز (lyases)، 5) ایزومراز (isomerases)، 6) لیگاز (ligases) . دو شماره بعدی نشاندهنده ساب کلاس و ساب – ساب کلاس که به انزیم نسبت داده میشود.برای نمونه این شماره ها ممکن است ساب کلاس امینوترانسفر را از فسفات ترانسفر و یا ساب – ساب کلاس پذیرنده اتاول را از پذیرنده گروه های اسیل متمایز کند.شماره پایانی یک شماره سریال اختصاصی است که به انزیم در درون ساب-ساب کلاس آن داده میشود.

برای نشان دادن اینکه این سیستم چگونه در نامگذاری یک انزیم استفاده میشود انزیم کراتین کیناز را در نظر بگیرید که واکنش زیر را کاتالیز میکند.

جدول 15-1 برخی انزیم های دارای ارزش بالینی را فهرست کرده است که با نام های عملی ،کوتاه و سیستماتیک و شماره کدهای آنها نام گذاری شده اند.اگرچه توسط کمیته انزیم شناسی توصیه نشده است اما استفاده از نام های کوتاه با حروف بزرگ برای نامیده برخی انزیم ها مانند ALT (پیشتر GPT) برای الانین امینوترانسفراز معمول و آسان است.دیگر نمونه ها شامل AST برای اسپارتات امینوترانسفراز و LD برای لاکتات دهیدروژناز و CK برای کراتین کیناز است.

انزیم ها به عنوان پروتیین (enzymes as proteins)

همه مولکولهای انزیم ویژگی های ساختاری اول (primary) ، دوم (secondary)،و سوم (tertiary) پروتیین ها را دارا هستند.

افزون بر این ها بیشتر انزیم ها ساختار چهارم (quaternary) را نشان میدهند.ساختار اول یعنی توالی خطی امینواسید ها که از طریق گروه های الفا-کربوکسیل و الفا-امینو به وسیله پیوندهای پپتیدی به هم وصل شده اند برای هر نوع مولکول انزیم اختصاصی است.هز زنجیر پلی پپتیدی به یک ساختار سه بعدی دوم و سوم پیچ خورده است.ساختار دوم به بخش های محدود از زنجیر پلی پپتیدی گفته میشود و ساختارهایی هستند به نام های مارپیچ های الفا (α-helices)،ورق های چین دار بتا (β-pleated sheets)،مارپیچ های تصادفی (random coils)،و خم های بتا (β-turns).ارایش عناصر ساختار دوم و برهم کنش های زنجیر جانبی امینو اسید است که ساختار سه بعدی پروتیین پیچ خورده را با عنوان ساختار سوم تعریف میکند.در بسیاری از موارد فعالیت زیستی مانند فعالیت کاتالایتیک انزیم ها نیازمند دو یا چند زنجیر پلی پپتید پیچ خورده (subunits) تا با هم همکاری کنند و یک مولکول عمل کننده را شکل دهند.آرایش این زیرواحدها (subunits) ساختار چهارم (quaternary structure) را تعریف میکند.زیر واحدها ممکن است نسخه هایی از زنجیر پلی پپتید یکسان ( مانند ایزو انزیم MM کراتین کیناز و یا ایزو انزیم H4 لاکتات دهیدروژناز) باشد و یا ممکن است پلی پپتید هایی ناهمسان باشند.

بکار گیری روشهای فیزیکی مانند کریستالوگرافی با پرتو ایکس و رزونانس مغناطیسی هسته ای چند بعدی (NMR) بینش های ساختاری مکانیسم انزیمی را آشکار کرده است.دیگر اینکه ابزارهای زیست شناسی مولکولی مانند کلونینگ مولکولی (molcular cloning) تخلیص (purification) و تعیین ویژگی انزیم ها را که پیشتر تنها در مقدارهای کم امکان داشت در مقدارهای بیشتر امکان پذیر کرده است.زیست شناسی مولکولی همچنین دستکاری توالی امینواسیدهای انزیم ها را و جهش زایی مکان دلخواه (site-directed mutagenesis) و جهش زایی حذفی (deletion mutagenesis) ( یعنی برداشت بخشی از ساختار اول) شناسایی گروه های شیمیایی که در اتصال لیگاند و مرحله های شیمیایی خاص طی کاتالیز نقش دارند را امکان پذیر کرده است.

بطور کلی ویژگی ساختار اول مانند تکرار توالی خاص از امینواسیدها در همه مولکولهای انزیم معمول نیست.با این حال همسانی چشمگیری در توالی ها بین انزیم هایی که سرچشمه تکاملی مشترک دارند وجود دارد مانند پروتئازها،تریپسین و کیموتریپسین.و همسانی توالی ها در بین اعضای خانواده ایزوانزیم ها چشمگیرتر است.توالی امینواسید در همسایگی نزدیک جایگاه فعال انزیم اغلب در انزیم هایی با عملکرد مرتبط خیلی شبیه است(مانند سرین پروتئازها که همه آنها امینواسید سرین را در جایگاه فعال خود دارند) .

مولکولهای انزیم در نسبت ساختارهای دوم مانند الفا-هلیکس ها با یکدیگر تفاوت دارند.ساختار سوم انواع مختلف مولکولهای انزیم همانند ساختار اول آنها بسیار خاص است.با این حال برخی ویژگی های مشترک وجود دارد.مولکولهای انزیم در شکل کلی بسیار کروی هستند بطوری که زنجیر جانبی امینواسیدهای قطبی در بیرون مولکول و زنجیرهای جانبی غیرقطبی در درون مولکول جاگرفته اند.

رزیدیو (residue) های یونیزه شونده در تماس با محیط پیرامون انزیم مسوول بسیاری از ویژیگی های مولکول انزیم در محلول است مانند مهاجرت آنها در میدان الکتریکی و حل شدن آنها .پل های دی سولفید کووالانسی ممکن است بخشهایی از زنجیر های پلی پپتید را در برخی انزیم ها متصل کند اما ساختار سه بعدی بیشتر به وسیله شمار زیادی از برهم کنش های هیدروفوب که بین زنجیرهای جانبی غیر قطبی در درون مولکول شکل میگیرند، پایدار میشود.

فعالیت زیستی یک مولکول پروتیین بطور کلی بستگی به کل ساختار آن دارد و هر گونه گسستگی در ساختار همراه است با کاهش فعالیت، فرایندی که به آن دناتوراسیون (denaturation) میگویند.اگر فرایند دناتوراسیون کمینه باشد،فغالیت انزیم با حذف عامل دناتوره کننده باز میگردد.با این حال شرایط دناتوره کننده طولانی و یا شدید منجر به کاهش برگشت ناپذیر فعالیت انزیم میگردد.شرایط دناتوره کننده شامل دمای بالا ، pH بیش از حد و افزودن مواد شیمیایی است.غیر فعال شدن با گرما با یک سرعت چشمگیر در دمای اتاق درباره بسیاری از انزیم ها رخ میدهد و در دمای بالای 60 C تقریبا بطور ناگهانی غیرفعال میشوند.پلیمرازها یک استثنا هستند و فعالیتشان را در دمای 90 C هم حفظ میکنند این ویژگی است که استفاده از آنها را در واکنش زنجیری پلیمراز امکان پذیر کرده است(فصل 17( .از دماهای پایین برای حفظ فغالیت انزیم ها به ویژه در محلول های آبی مانند سرم ها استفاده میشود.pH بیش از اندازه هم سبب باز شدن پیچ و تاب های ساختار مولکولی آنزیم میشود و به غیر از چند استثنا هنگام ذخیره سازی نمونه های انزیمی باید پرهیز شود.افزودن مواد شیمیایی مانند اوره و دترجنت ها پیوند های هیدروژنی و برهم کنش های هیدروفوبی را گسسته طوری که محلول های قوی دارای این ریاجنتها منجر به غیر فعال سازی انزیم ها میشود.

 

اختصاصیت و جایگاه فعال (specificity and the active center)

به استثنای انزیم هایی مانند پروتئاز ها ،نوکلئازها و امیلازها که بر روی سوبستراهای ماکرومولکولی عمل میکنند دیگر مولکولهای انزیمی بطور چشمگیری از مولکولهای سوبسترایشان بزرگتر هستند.در نظر گرفتن ساختار جایگاه فعال انزیم و ارتباط آن با ساختار سوبسترای انزیم در دو وضعیت پایه (ground state) و گذار (transition state) برای فهم افزایش سرعت و اختصاصیت واکنش های شیمیایی که توسط انزیم انجام میشود لازم است.جایگاه فعال انزیم در انزیم ها بسیار باهم تفاوت دارند اما بطور کلی

1. جایگاه فعال انزیم در مقایسه با حجم کل انزیم کوچک است و در حدود 5% کل امینواسیدهای مولکول انزیم را شامل میشود.
2. جایگاه فعال انزیم ها ساختار سه بعدی دارد و در نتیجه ساختار سوم سرتاسری پروتیین شکل میگیرد.این جایگاه هنگامی حاصل میشود که امینواسیدها و کوفاکتورها در جایگاه فعال یک انزیم از نظر فضایی در یک ارتباط دقیق و سه بعدی با یکدیگر و با ساختار مولکول سوبسترا جهت گیری کرده باشند.
3. بطور طبیعی جذب بین مولکولهای انزیم و مولکول های سوبسترای آنها یک اتصال غیر کووالانسی است.نیروهای فیزیکی که در این نوع اتصال شرکت دارند شامل پیوند هیدروژنی (hydrogen bonding)، برهم کنش های الکترواستاتیک و هیدروفوبیک (electrostatic and hydrophobic interaction) و نیروهای واندروالس ( van der waals ) است.
4. جایگاه فعال انزیم ها بطور معمول در شکاف ها و شیارهای پروتیین قرار گرفته اند.
5. اختصاصیت اتصال به سوبسترا عملکردی است از ترتیب خاص و دقیق  اتم ها در جایگاه فعال انزیم طوری که مکمل  ساختار مولکول سوبسترا میشود.

 

 

ایزوانزیم ها و دیگر چند شکلی انزیم ها (isoenzymes and multiple forms of enzymes)

ایزو انزیم ها (isoenzymes) به گروهی از انزیم های مرتبط گفته میشود که واکنش یکسانی را کاتالیز میکنند اما ساختارهای مولکولی متفاوت داشته و دارای ویژگی های فیزیکی ، بیوشیمیایی و ایمونولوژیکی متفاوتی هستند.با این حال IUB توصیه میکند که استفاده از واژه ایزوانزیم محدود به شکل هایی از انزیم شود که سرچشمه آنها ژن (ها) یی باشد که ساختار پروتیینی این انزیم ها را کد میکنند.

ایزوانزیم ها ممکن است درون یک اندام منفرد باشند و یا حتی درون یک نوع سلول منفرد.ایزوانزیم ها را میتوان بر پایه تفاوت های فیزیکی آنها مانند حرکت الکتروفورتیک (electrophoretic mobility) و پایداری در برابر مواد شیمیایی و گرما از یکدیگر بازشناخت.ایزوانزیم ها اغلب تفاوت های قابل اندازه گیری در ویژگی های کاتالیزی دارند اما همه شکل های یک انزیم ویژه توانایی کاتالیز واکنش خاص خود را حفظ میکنند.

وجود چندشکلی در بین انزیم ها در بافتهای انسانی معنای مهمی در بررسی بیماری های انسانی دارد.وجود ایزوانزیم ها در اندام های مختلف با ویژگی های مشخص به ما در فهم الگوهای متابولیک خاص اندام ها کمک میکند اما از طرفی دیگر از نظر ژنتیکی تفاوت در ساختار انزیمی بین افراد مختلف مشخص شده است و همین مسوول وجود تفاوت در حساسیت متفاوت به داروها و تفاوت در متابولیسم است که خودشان را به شکل بیماریهای متابولیک ارثی آشکار میکنند.در انزیم شناسی تشخیصی وجود چندشکلی انزیمی جدای از اینکه ریشه ژنتیکی یا غیر ژنتیکی داشته باشد اختصاصیت (specificity) و حساسیت (sencitivity) تشخیصی را سنجش های انزیمی را در نمونه های مایع بدن انسان فراهم میکند.

همانند دیگر پروتیین ها انزیم ها معمولا هنگامی که به جانورانی غیر از گونه ای که در آن ساخته شده اند تزریق شوند تولید انتی بادی ها را بر ضد خود بر می انگیزانند.حتی یک تفاوت ساختاری کوچک بین مولکولهای همانند به هم مرتبط مانند اعضای یک خانواده ایزوانزیمی اغلب کافی است تا از نظر آنتی ژنیکی از یکدیگر بازشناخته شوند و به انتی بادی ها این اجازه را دهند که ضد یک نوع مولکول خاص از آنها ساخته شود.وجود روشهای ایمونوشیمیایی به ویژه در انالیز مخلوط ایزوانزیمی مهم می باشد.بسیاری از روشهای ایمونواسی کنونی از انتی بادی های منوکلونال برای افزایش اختصاصیت بهره میگیرند.

 

 

منشاهای ژنتیکی واریانت های انزیم (genetic origins of enzyme variants)

ایزوانزیم های واقعی از بیش از یک لوکوس ژنی که ساختار پروتیین انزیم را کد میکند سرچشمه میگیرند.بسیاری از انزیم های انسانی (شاید بیش از یک سوم آنها ) معلوم است که به وسیله بیش از یک لوکوس ژنی ساختاری کد میشوند.ژتها در لوکوس های مختلف اصلاحات متمایزکننده ای (differential modification) را طی دوره تکامل (evolution)به خود دیده اند طوری که پروتیین های انزیم ها که توسط آنها کد میشوند دیگر ساختارهای یکسانی ندارند اگر چه از نظر شناختی همانند به شمار می آیند به عبارت دیگر ایزوانزیم یکدیگر هستند.

چندین ژن که که یک گروه ویژه از ایزوانزیم ها را کد میکنند الزاما نزدیک هم و روی یک کروموزوم واقع نشده اند.برای نمونه ژنهای ساختاری که امیلازهای بزاق و پانکراس انسانی را کد میکنند هر دو روی کروموزوم 1 واقع شده اند درحالی که ژنهای کد کننده مالات دهیدروژناز سیتوپلاسمی و میتوکندریایی به ترتیب روی کروموزوم های 2 و 7 قرار گرفته اند.

از میان انزیم های دارای اهمیت بالینی که بخاطر چندین لوکوس ژنی به شکل ایزوانزیم حضور دارند میتوان لاکتات دهیدروژناز،کراتین کیناز، الفا-امیلاز و برخی شکل های الکالین فسفاتاز را نام برد.

یک انزیم میتواند به شکل های مولکولی وجود داشته باشد که از یک فرد به فرد دیگر فرق میکند و این بخاطر االل های الترناتیو (alternative allels) است که طبق قانون مندلی به ارث میرسند.این سبب تولید محصولات ژنی میشود که عملکرد یکسانی دارند و ایزوانزیم هایی که از این ژنهای اللی ساخته میشوند الوزیم (allozymes) نامیده میشوند.نسبت لوکوس های ژنی انسانی که در معرض تغییرهای اللی هستند چشمگیر است و به احتمال زیاد افراد در الگوی ایزوانزیمی تا اندازه چشمگیری با یکدیگر فرق دارند.

شمار واریانت های اللی (allelic variants) و فراوانی یک واریانت خاص درون یک جمعیت بطور چشمگیری از یک انزیم تا انزیم دیگر فرق میکند.برای نمونه جهش ها در هر یک از دو لوکوس اصلی که لاکتات دهیدروژناز انسانی را کد میکنند بی اندازه کمیاب است اما رخداد بسیار بالایی (high incidence) از الل های جهش یافته در تنها لوکوس الکالین فسفاتاز جفتی وجود دارد.بیش ار 400 جهش در ژن گلوکز 6-فسفات دهیدروژناز بر روی کروموزوم X شناسایی شده است.برخی از این الل ها بی اندازه کمیاب هستند در حالی که دیگر الل ها فراوانی چشمگیری در یک جمعیت خاص و یا منطقه جغرافیایی خاص دارند.هنگامی که ایزوانزیمی بخاطر تغییر در یک لوکوس منفرد با یک فراوانی بسیار بالا در جمعیت انسانی وجود داشته باشد آن جمعیت نسبت به آن ایزوانزیم پلی مرفیک محسوب میشود.

دیگر چند شکلی مولکولی هنگامی است که انزیم ها بصورت الیگومریک (oligomeric) هستند و از مولکولهایی تشکیل شده اند که به آنها زیرواحد (subunit) گفته میشود.مشارکت گونه های مختلف زیرواحدها با ترکیب های مختلف منجر به طیفی از مولکولهای انزیم فعال میگردد.هنگامی که زیرواحدها از ژنهای ساختاری جداگانه ای-چندین لوکوس یا چندین الل- ریشه گرفته باشند مولکولهای هیبریدی شکل گرفته ایزوانزیم های هیبرید(hybrid isoenzyme) نامیده میشوند.توانایی تشکیل ایزوانزیم های هیبرید نشاندهنده همانندی ساختاری قابل توجه بین زیرواحدهای مختلف است.ایزوانزیم های هیبرید به صورت in vitro هم ساخته میشوند اما بصورت in vivo در سلولهایی که انواع مختلف زیرواحدهای تشکیل دهنده در یک محفظه زیرسلولی یکسان وجود دارند نیز ساخته میشوند.

شمار ایزوانزیم های هیبرید مختلف که از دو پروتومر (protomer) غیر یکسان میتواند ساخته شود به شمار زیرواحدها در مولکول کامل انزیم بستگی دارد.برای یک انزیم دایمریک یک دایمر مخلوط (hybrid isoenzyme) مبتواند تشکیل شود.اگر انزیم یک تترامر باشد سه ایزوانزیم هتروپلیمریک میتواند تشکیل شود(شکل 15-1).نمونه هایی از ایزوانزیم های هیبرید، دایمر MB مخلوط کراتین کیناز و سه ایزوانزیم هیبرید – LD2 , LD3, LD4 – لاکتات دهیدروژناز میباشند.

علت های غیرژنتیکی چند شکلی انزیم ها (nongenetic causes of multiple forms of enzymes)

تغییرهای پس از ترجمه (post-translational modificatopns) مولکولهای انزیم منجر به چندشکلی میشود که به آن ایزوفرم (isoform) گفته مشود(شکل 15-2).

تغییر رزیدیوها در زنجیرهای پلی پپتید مولکولهای انزیم ها در سلولهای زنده رخ میدهد و سبب چند شکلی در انزیم ها میگردد.برای نمونه برداشت گروههای امید(amide groups) علت ناهمگونی (heterogeneity) امیلاز و کربنیک انیدراز (هر کدام از این انزیم ها بصورت ایزوانزیم واقعی نیز وجود دارند) است.تغییرات همچنین در نتیجه روشهای استخراج رخ میدهند.بسیاری از انزیم های اریتروسیت شامل ادنوزین دامیناز(adenosine deaminase)،اسید فسفاتاز(acid phosphatase)،و برخی شکل های فسفوگلوکوموتاز(phosphoglucomutase) دارای گروههای سولفیدریل (sulfhydryl) هستند که به اکسیداسیون حساس هستند.

در همولایزیت ها (hemolysates) اکسیداسیون ممکن است به وسیله گلوتاتیون اکسید شده (oxidized glutathione) ایجاد شود اگرچه در سلولهای دست نخورده این مولکول به شکل کاهیده (reduced form) خود حضور دارد.بنابراین مولکولهای انزیم واریانت با بار مولکولی تغییر یافته ممکن است در سلول ایجاد شوند.

ایزوفرم های سرمی کراتین کیناز در بخشی از فرایند پاکسازی طبیعی سلول ایجاد میشوند.بافتهای عضلانی میوکارد و اسکلتی دارای ایزوانزیم های CK-MM و CK-MB هستند که به محض ورود به گردش خون تغییر میبابند.این تغییر ناشی از برداشت پی در پی امینو اسید انتهای C -لایزین – به وسیله عملکرد کربوکسی پپتیداز است.

تغییرهایی که بر بخشهای غیرپروتیینی مولکولهای انزیم اثر میگذارند نیز منجر به ناهمگونی مولکولی میشوند.بسیاری از انزیم ها گلایکوپروتیین هستند و تغییرها در زنجیرهای جانبی کربوهیدرات یک علت معمول ناهمگونی فراورده های این انزیم ها میباشد.برخی دنباله های کربوهیدراتی به ویژه N-acetylneuraminic acid (سیالیک اسید =sialic acid) بسیار یونیزه هستند و در نتیجه اثر قوی بر برخی ویژگی های مولکول انزیم دارند.برای نمونه برداشت گروههای سیالیک اسید انتهایی از الکالین فسفاتاز کبدی یا استخوانی به وسیله نورامینیداز ناهمگونی الکتروفورزی انزیم را بسیار کاهش میدهد.

 

توده شدن (aggregation) مولکولهای انزیم با همدیگر یا با پروتیین های غیرانزیمی ممکن است منجر به چندین شکل گردد که آنها را میتوان با تکنیکهای جداسازی بر پایه اندازه مولکولی جدا کرد.برای نمونه چهار جز کولین استراز (cholinesterase) که وزن مولکولی آنها از 80000 تا 340000 است در بیشتر سرم ها یافت میشود که سنگین ترین جز ،C4 ، بیشترین فعالیت انزیمی را داراست.دیگر شکلهای انزیم نیز گهگاهی حضور دارد اما به نظر میرسد بخش اصلی کولین استراز سرمی را میتوان به حالت های مختلف توده ای از یک مونومر منفرد نسبت داد.

یگ شکل ویژه ای از برهم کنش بین پروتیین های انزیمی و غیر انزیمی سبب تشکیل بخشهای انزیمی غیرعادی به هنگام بخش بندی (fractionation) برخی پلاسماهای انسانی در الکتروفورز یا کروماتوگرافی میشود.این بخش ها در نتیجه ترکیب انزیم طبیعی یا ایزوانزیم طبیعی با ایمونوگلوبولین های پلاسما میباشد.کمپلکس های انزیم – پروتیین (macrocomplexes) که به این شکل تشکیل میشوند خود ممکن است ناهمگون باشند.از زمان شناسایی ماکروامیلاز کمپلکس های همانند آن که شامل لاکتات دهیدروژناز ،کراتین کیناز،الکالین فسافتاز و دیگر انزیم ها شناسایی شده اند.

یک زنجیر پلی پپتیدی تک از نظر تئوری شمار مشخصی از شکل های فضایی (conformations) مختلف را میتواند داشته باشد.با این حال یک شکل فضایی ویژه بطور کلی به نظر میرسد برای هر توالی امینواسید از همه پایدارتر باشد.بنابراین ساختار اول زنجیر پلی پپتید ساختارهای سه بعدی دوم و سوم را تعیین میکند.قابل تضور است که در برخی موارد چندین شکل فضایی الترناتیو (conformers) از یک زنجیر تک وجود دارند که بطور یکسان پایدار هستند و بنابراین این شکل های الترناتیو ممکن است همزمان وجود داشته باشند.چنین امکانی اول بار برای پاسخگویی به ناهمگونی دیده شده در فراورده های ایروانزیم های مالات دهیدروژناز سیتوپلاسمی و میتوکندریایی پیشنهاد شد و همچنین برای توضیح چندین زون الکتروفورزی اسید فسفاتاز اریتروسیت پیشنهاد گردید.با این حال ایزومریسم فضایی (conformational isomerism) به عنوان علت چند شکلی انزیمی با شک همراه بوده است.

 

 

توزیع ایزوانزیم ها و دیگر چندشکلی انزیم ها (distribution of isoenzymes and other multiple forms of enzymes)

وجود لوکوس های چند ژنی و ایزوانزیم های برگرفته از آنها احتمالا یک برتری تکاملی گونه ای داده و بنابراین بخشی از الگوی متابولیک طبیعی آن شده است.برخی از این سازگاری ها مربوط به تقسیم عملکرد بین و درون انواع مختلف سلولها و بافتهای تخصص یافته است.بنابراین توزیع ایزوانزیم ها در سرتاسر بدن یکنواخت نیست و نوسان گسترده ای در فعالیت ایزوانزیم های مختلف در سطح اندام ،سلول و زیرسلولی دیده شده است. تفاوت ویژه بافت نیز در توزیع برخی چند شکلی انزیم ها یافت شده است که ناشی از وجود چند لوکوس ژنی نیست .توزیع ویژه بافتی ایزوانزیم ها و دیگر چندشکلی انزیم ها پایه تشخیص گذاری ویژه اندام از طریق اندازه گیری ایزوانزیم ها ست.

برخی لوکوس های ژنی ممکن است بطور انحصاری در یک بافت تک بیان (express) شوند،شاید در یک مرحله ویژه ای از رشد.افزون بر دو لوکوس ژنی دو زیر واحد بیشتر معمول لاکتات دهیدروژناز را تعیین میکنند یک لوکوس سومی تنها در بافت بیضه بالغ فعال است.این لوکوس ساختار نوع سوم زیر واحد ،X، یا C را تعیین میکند که یک ایزوانزیم خاص ،LD-X یا LDc را تنها در بافتهای بیضه سبب میشود.ایزوانزیم ALP که در جفت انسانی یافت میشود محصول یک لوکوس ژن ساختاری تک است که از لوکوس هایی که ساختار دیگر شکل های ALP را تعیین میکنند متمایز است و محصول این لوکوس فسفاتاز جفتی بطور طبیعی تنها در جفت قابل تشخیص است.

 

یک نمونه برجسته از بیان محلی (local expression) چند لوکوس ژنی ایزوانزیم های مشخصی هستند که بطور انحصاری در اندامک های زیرسلولی خاصی حضور دارند.تفاوت بین ایزوانزیم های میتوکندریایی و همانندهای عملکرددی آنها در سیتوپلاسم در چندین مورد نشان داده شده است (بعنوان نمونه در مورد اسپارتات امینوترانسفراز و مالات دهیدروژناز).

 

تغییر در توزیع ایزوانزیم ها طی رشد و بیماری ها (changes in isoenzyme distribution during development and desease)

الگوی چند گروه از ایزوانزیم ها طی رشد طبیعی در بافتهای بسیاری از گونه ها تغییر میکند.برای نمونه طی رشد جنینی عضله های اسکلتی ویژگی های الکتروفورزی بیشتر ایزوانزیم های کاتدی – هم LD و هم CK – بطور پیشرونده ای در بافت،تا حدود 6 ماهگی زندگی درون رحمی حدی که الگو همانند عضله تمایز یافته میشود،افزایش می یابد.

کبد نیز تغییرهای ویژه ای را در الگوهای چندین ایزوانزیم طی دوران جنینی نشان میدهد.طی رشد جنینی سه ایزوانزیم الدولاز – A,B,C – همراه با تترامرهای هیبرید را میتوان در عصاره های کبدی شناسایی کرد.با این حال در تولد همانند کبد افراد بالغ الدولاز B ایزوانزیم غالب مباشد.تغییرهای برجسته ای نیز در توزیع ایزوانزیم های الکل دهیدروژناز (alcohol dehydrogenase) در کبد انسانی طی رشد جنینی رخ میدهد.

تغییر در الگوهای ایزوانزیمی طی رشد نتیجه تغییر در فعالیت های مربوط به لوکوس های ژنی درون سلولهای رشد یابنده (برای نمونه سلولهای عضله ) است.دیگر تغییرها در تعادل ایزوانزیم ها در کل ارگانیزم از تغییر در شمار یا فعالیت سلول هایی که دارای مقدار زیادی از یک ایزوانزیم ویژه هستند ریشه میگیرد.یک نمونه از این،افزایش شمار و فعالیت استئوبلاست ها (osteoblasts) است که مسوول معدنی سازی (mineralization) اسکلت بین دوره اوایل پس از زایمان تا آغاز دهه سوم زندگی است .مازاد ALP از استئوبلاستهای فعال وارد گردش خون میشوند جایی که حضور آن را به وسیله ویژگی های ویژه خودش میتوان شناسایی کرد و این سبب افزایش فعالیت ALP کل سرم افراد جوان به بالاتر از مقداری که افراد بالغ دارند میشود.ALP کبدی نیز در فعالیت کل این انزیم در پلاسمای افراد سالم همکاری میکند و مقدار این ایزوانزیم در پلاسما یک افزایش پیشرونده کم را با گذشت سن نشان میدهد.

برخی بیماری ها مانند دیستروفی عضلانی پیشرونده به نظر میرسد که در آن بافت درگیر یا بطور طبیعی بلوغ نمی یابد و یا وضعیت طبیعی را نمی تواند برقرار نماید.بسیاری از سلولهای سرطانی نیز ساختار و متابولیسم سلولهای سالم در بافتهای درگیر بطور پیشرونده ای از دست میرود.بنابراین الگوی ایزوانزیم های بافتهای بالغ و تمایز یافته ممکن است در صورتی که تمایز طبیعی متوقف شود، از دست برود و یا تغییر یابد

توزیع ایزوانزیم های الدولاز ،LD، و CK در عضله بیماران دیستروفی عضلانی پیشرونده نشان داده شده که همانند عضلات جنینی در حال رشد است.غیر طبیعی بودن ایزوانزیم ها در این بیماری بیانگر نارسایی در رسیدن و یا برقراری درجه ای از تمایز طبیعی است.الگوهای ایزوانزیم که در بافتهای بازسازی کننده دیده میشود نشاندهنده مقداری گرایش به توزیع جنینی است.این گرایش ممکن است ناشی از استراحت یا تغییر سیستم کنترلی در سلولهای به سرعت تقسیم شونده باشد و مسول برخی تغییر در ایزوانزیم ها (به عنوان نمونه در عضله های پلی مایوزیت حاد).

بازپدیدی الگوهای جنینی توزیع ایزوانزیم ها یک ویژگی تغییر شکل های بدخیم در بسیاری از بافتها است.این پدیده اول بار بطور گسترده ای درباره ایزوانزیم های لاکتات دهیدروژناز بررسی گردید.تومورهای بدخیم بطور کلی یک سوگرایی چشمگیری درتعادل ایزوانزیمی به سوی فرم های بیشتر کاتدی در الکتروفورز،مانند LD-4 و LD-5 نشان میدهند.کاهش در فعالیتهای ایزوانزیم های LD-1 و LD-2 منجر به الگویی هایی میشود که یادآور بافتهای جنینی است.تومورهای پروستات ،سرویکس ،پستان ،مغز،معده ،روده ،مقعد،برونش ها ،و گره های لنفاوی از آن دسته هایی هستند که این تغییر شکل ها را نشان میدهند.بر خلاف این گلیوماهای خوش خیم یک افزایش نسبی در ایزوانزیم های انیونی در خود نشان میدهند.

 

تفاوت در ویژگی ها بین انزیم های چندشکلی (differences in properties between multiple forms of enzymes)

تفاوت ساختار بین چندین شکل از یک انزیم منجر به بزرگتر یا کمتر شدن تفاوت ها در ویژگی های فیزیکو شیمیایی مانند حرکت الکتروفورزی،مقاوت در برابر غیرفعال شدن و حلالیت و یا در ویژگی های کاتالیزی مانند نسبت واکنش با انالوگهای سوبسترا و یا پاسخ به مهارکننده ها میگردد.روشهای انالیز ایزوانزیم بنابراین طراحی شد تا گستره وسیعی از ویژگی های کاتالیزی و ساختاری مولکولهای انزیم را بررسی کند.با این حال معمولا تنها نتیجه گیری کمی در مورد ماهیت تفاوتهای ساختاری بین ایزوانزیم ها که مسوول ناهمسانی ویژگی ها هستند، میتوان گرفت.به همان اندازه تغییرها در کاتالیز و دیگر ویژگی ها که ممکن است از تغییرهای ساختاری خاصی ریشه بگیرند سخت است که بتوان با دانش تئوری موجود ارتباط بین ساختار و عملکرد پروتیین را با آن پیش بینی کرد.

تکنیک های زیست شناسی مولکولی مانند کلون کردن ژن (gene cloning) و تعیین توالی ژنی (gene sequencing) بررسی ساختار اول ایزوانزیم ها را دگرگون کرده است.تفاوت در ساختار اول بین ایزوانزیم ها چه از لوکوسهای چند ژنی ریشه گرفته باشند یا از الل های مختلف اکنون معلوم شده که در یک شمار فزاینده ای از موارد وجود دارد.افزون بر آن بسیاری از سوال ها درباره اینکه چندشکلی انزیمی ایا حقیقی (ژنتیکی تعیین شده ) است یا اینکه از اصلاحات پس از ترجمه (post translational modification) ریشه گرفته،پاسخ داده شده است.

ایزوانزیم هایی که از لوکوس های چند ژنی ریشه گرفته اند معمولا از نظر ویژگی های کاتالیزی قابل اندازه گیری فرق دارند.این تفاوت ها ممکن است در ویژگی هایی چون فعالیت مولکولی (molecular activity)،مقدار Km برای سوبسترا(ها)،حساسیت به مهارکننده های مختلف و میزان نسبی فعالیت با انالوگهای سوبسترا (هنگامی که اختصاصیت ایزوانزیم ها اجازه میدهد که سوبسترا تغییر کند)، همه اینها تاکیدی بر اهمیت بیولوژیکی تغییرهای ایزوانزیمی است .در مقابل چند شکلی انزیمی که از تغییرهای پس از ترچمه ریشه گرفته اند همانند توده شدن (aggregation) معمولا ویژگی های کاتالیزی یکسانی دارند.

ایزوانزیم های چند لوکوسی (multilocus isoenzymes) همچنین معمولا از نظر اختصاصیت انتی ژنی فرق دارند اگر چه این تفاوت ها ممکن است در بین ایزوانزیم هایی که به تازگی در تاریخچه تکامل شناخته شده اند و در ساختار به هم بسیار نزدیک هستند، باشد..واکنش متقاطع ایمونولوژیکی (immunological cross-reaction) بین ایزوانزیم های چند لوکوسی غیر معمول نیست .شکل های انزیمی که به وسیله تغییرهای پس از ساخت ایجاد میشوند معمولا  به وفور شاخص های انتی ژنی مشترکی دارند.ایزوانزیم هایی که از ژنهای اللی ریشه گرفته اند (allozymes) بیشتر از نظر ژنتیکی همانند هستند حتی تا اندازه ای که ممکن است با انتی سرم های ایزوانزیم های معمول واکنش متقاطع دهند حتی اگر یک جهش فعالیت انزیم را کاملا متوقف کرده باشد.ظرفیت تشخیص تفاوت ها مولکولهای ایزوانزیم همانند از نظر انتی ژنی بستگی به اندازه اختصاصیت انتی بادی منوکلونال دارد.

تفاوت در ایستادگی در برابر دناتوراسیون (به وسیله گرما ،محلولهای اوره غلیظ ،و دترجنتها ) معمولا بین ایزوانزیم های حقیقی چه اینکه محصول چند لوکوس باشند یا محصول چند الل ،بطور معمول یافت میشوند.

دیگر چند شکلی های انزیمی اغلب فرق نمیکنند یا تنها به میزان کمی در این باره فرق میکنند.بیشترین تفاوت بهره برداری شده بین ایزوانزیم ها تفاوت در بار مولکولی خالص است که از ترکیبات امینواسیدی تغییر یافته مولکولها نتیجه میشود و این پایه جدا سازی آنها به وسیله زون الکتروفورز ،کروماتوگرافی تعویض یون و یا ایزوالکتریک فوکوسینگ است. روشهایی که جداسازی بستگی به تفاوت در اندازه مولکولی دارد مانند ژل فیلتراسیون نمیتواند تفاوت های کوچک اندازه ای را که اغلب بین ایزوانزیم های حقیقی وجود دارد تشخیص دهد اما این روش در تشخیص چند شکلی هایی که شامل توده شدن (aggregation) ویا مشارکت (association) با دیگر پروتیین ها است ،مهم است.

 

انزیم ها به عنوان کاتالیست (enzymes as catalysts)

یک کاتالیست ماده ای است که سرعت یک واکنش شیمیایی خاص را تغییر میدهد و یا افزایش میدهد بدون آنکه خود مصرف شود و یا همیشه تغییر یابد.انزیم ها کاتالیست های پروتیینی با ریشه بیولوژیکی هستند.متابولیسم یک سری واکنشهای شیمیایی هماهنگ است که درون یک سلول زنده برای فراهم کردن انرژی و انجام بیوسنتز رخ میدهد.فرایند را میتوان یعنوان یک سری واکنشهای به هم پیوسته انزیمی دانست و برخی بیماری ها را گسیختگی الگوی طبیعی متابولیسم در نظر گرفت.جدای از این ملاحظه های پایه ای از ویژگی های برجسته انزیم ها این است که آنها شاخص هایی حساس در تغییرهای آسیب شناختی هستند.

بخاطر فعالیت کاتالیزی برجسته انزیم ها تنها شمار کمی از مولکولهای انزیم شمار فراوانی از مولکولهای سوبسترا را در مدت زمان کوتاهی به محصول تبدیل میکند.از این ویژگی برای اندازه گیری مقدارهای افزایش یافته انزیم ها در گردش خون استفاده میشود اگر چه مقدار پروتیین انزیم ازاد شده از سلول اسیب دیده در مقایسه با مقدار کل پروتیین های غیر انزیمی در خون کم باشد.بنابراین تغییر در مقدار یک انزیم خاص به وسیله اثر ویژه آن بر یک واکنش شیمیایی شناسایی میشود.

 

واحدها برای بیان فعالیت انزیم (units for expressing enzyme activity)

 

هنگامی که انزیم ها به وسیله فعالیت کاتالیزی شان اندازه گیری میشوند نتایج آن بصورت شمار واحد های فعالیت در حجم یا جرم نمونه بیان می شوند. واحد فعالیت سنجشی از سرعت است که در آن واکنش به پیش میرود (برای مثال سوبسترای مصرف شده یا محصول تولید شده در واحد زمان).در انزیم شناسی بالینی فعالیت یک انزیم بطور کلی در واحد حجم بیان میشود.مانند فعالیت در  100 mL یا در  1 L سرم یا در  1 mL از اریتروسیت فشرده .از آنجایی که سرعت واکنش بستگی به پارامترهای آزمایش مانند ،pH ،نوع بافر، دما، ماهیت سوبسترا، توان یونی، غلظت فعال کننده ها و دیگر متغیرها دارد، این پارامترها باید در تغریف واحد مشخص شوند.

برای استاندارد کردن بیان فعالیت انزیم ها ،کمیسیون انزیم پیشنهاد کرد که واحد فعالیت انزیم بصورت مقدار انزیمی تعریف شود که 1 umoL از سوبسترا را در یک دقیقه کاتالیز میکند و این واحد باید به عنوان واحد بین المللی (U) تعریف شود.غلظت کاتالیزی بصورت U/L یا KU/L بیان میشوند که هریک مقدار عددی ساده ای را ارایه میدهد.در این بخش نماد U برای نمایش واحد بین المللی استفاده میشود.در مواردی که مقداری عدم قطعیت در باره ماهیت دقیق سوبسترا وجود دارد یا هنگامی که در محاسبه شمار میکرومول های که واکنش میدهند با مشکل روبرو شدیم (مثلا در مورد ماکرومولکولهایی مانند نشاسته ،پروتیین و لیپید های پیچیده ) واحد بصورت گروه شیمیایی یا رزیدیوی اندازه گیری شده در واکنش بیان میشود به عنوان مثال واحد های گلوکز و یا واحد های امینواسید تشکیل شده).

یک واحد گرفته شده از سیستم بین المللی واحدها برای قعالیت کاتالیزی (فصل 9 را ببینید) کاتال (katal) است که بصورت مول (moles) های تبدیل شده در یک ثانیه تعریف میگردد.نام katal برای دهه ها استفاده شده بود اما به عنوان واحد رسمی گرفته شده از SI (سیستم بین المللی واحدها) تا سال 1999 مورد قبول واقع نشد در این سال فدراسیون بین المللی شیمی بالینی و پزشکی ازمایشگاهی (IFCC) و اتحادیه بین المللی شیمی کاربردی و محض (IUPAC) و IUB  اکنون پیشنهاد میکنند که فعالیت انزیم بصورت مول بر ثانیه بیان شود و غلظت انزیم بصورت کاتال در لیتر (kat/L) بیان شود.

بنابراین 1U = 10^-6 / 60s  = 16.7 * 10^-9 mol/s   و یا 1.0 nkat/L = 0.06 U/L

 

 

کینتیک انزیم (enzyme kinetics)

کمپلکس انزیم – سوبسترا (the enzyme – substrate complex)

انزیم ها از طریق تشکیل یک کمپلکس انزیم – سوبسترا که در آن یک مولکول سوبسترا به جایگاه فعال (active center) مولکول انزیم متصل میشود، عمل میکنند.فرایند اتصال ،مولکول سوبسترا را به حالت فعال آن تبدیل میکند.انرژی مورد نیاز برای این تغییر شکل (transformation) به وسیله انرژی ازاد اتصال سوبسترا (S) به انزیم (E) فراهم میشود.بنابراین فعال سازی بدون افزودن انرژی بیرونی رخ میدهد طوری که سد انرژی برای انجام واکنش پایین آمده و شکست به سمت تولید محصول شتاب میگیرد.(شکل 15-3).

کمپلکس ES میشکند و محصول (ها) و انزیم ازاد (E) را به دست میدهد.

تمام واکنش های کاتالیز شده به وسیله انزیم ها از نظر تئوری برگشت پذیر هستند.با این حال در عمل واکنش معمولا به یک سمت سریعتر از سمت دیگر است طوری که یک تعادلی (equilibrium) بدست می آید که در آن محصول واکنش به جلو یا به عقب غلبه میکند و گاهی چنان برجسته است که واکنش برگشت ناپذیر میشود.

اگر محصول یک واکنش در یک سمت همانطوری که تشکیل میشود برداشت شود ( به عنوان مثال چون سوبسترایی است برای یک انزیم دوم در مخلوط واکنش) ،تعادل فرایند انزیمی اول طوری جابجا خواهد شد که واکنش به سمت کامل شدن به آن سمت پیش خواهد رفت .توالی های واکنش طوری که محصول یک واکنش کاتالیز شده با انزیم سوبسترا برای انزیم بعدی میشود و به همین ترتیب و از طریق چندین مرحله ،این از ویژگی های فرایندهای بیولوژیکی است.همچنین در آزمایشگاه چندین واکنش انزیمی ممکن است به همدیگر وصل شوند تا وسیله ای برای اندازه گیری فعالیت انزیم اول یا غلظت سوبسترای اغازین در زنجیر فراهم شود.برای نمونه فعالیت CK معمولا به وسیله یک سری واکنشهای به هم پیوسته اندازه گیری میشود و نیز غلظت گلوکز به وسیله واکنشهای پی در پی که توسط هگزوکیناز (hexokinase) و گلوکز 6-فسفات دهیدروژناز (G6PD) کاتالیز میشود اندازه گیری میگردد.

هنگامی که واکنش انزیمی دوم که به عنوان واکنش شاخص (indicator reaction) نامیده میشود برای تعیین فعالیت یک انزیم دیگر استفاده میشود ،واکنش انزیمی اول باید به عنوان مرحله محدود کننده سرعت (rate-limiting step) باشد.شرایط طوری گزینش میشود که اطمینان شود سرعت سرعت واکنش کاتالیز شده به وسیله انزیم شاخص (indicator enzyme) به طور مستقیم متناسب با سرعت تشکیل محصول در واکنش اول باشد.

 

فاکتورهای تعیین کننده در سرعت واکنشهای کاتالیز شده با انزیم

(factors govering the rate of enzyme-catalyzed reactions)

فاکتورهایی که بر سرعت واکنشهای کاتالیز شده با انزیم اثر میگذارند شامل انزیم و غلظت سوبسترا ،pH ، دما ، و وجود مهار کننده ها (inhibitors) ، فعال کننده ها (activators)، کوانزیم ها (coenzymes) ،و گروه های پروستتیک (prosthetic groups) می باشد.

 

غلظت انزیم (enzyme concentration)

ساده ترین واکنش کاتالیز شده به وسیله انزیم برای تبدیل سوبسترا S  به محصول P با تشکیل یک واسطه از کمپلکس ES در ادامه می اید.

که در آن :

Ef = انزیم ازاد

K1= ثابت سرعت برای تشکیل کمپلکس

k-1= ثابت سرعت برای تجزیه کمپلکس

ES= کمپلکس انزیم – سوبسترا

K2= ثابت سرعت برای شکست ES به Ef و P

P= محصول

میکائیلیس (Michaelis) و منتن (menten) فرض کردند که تعادل (equilibrium) به سرعت بین E و S و ES  با اثر تشکیل محصول (ES -> P) بطوری که غلظت ES قابل گذشت باشد،به دست میاید.افزون بر این ،تشکیل محصول به عنوان یک فرایند برگشت ناپذیر نوشته شده است چون در شرایط اغازین هیچ محصولی در محلول وجود ندارد.بنابراین سرعت کلی واکنش با دیگر شرایط ،ثابت بطور مستقیم با غلظت کمپلکس ES متناسب است.

با فراهم بودن مولکولهای سوبسترای ازاد و مازاد،افزودن مولکولهای انزیم بیشتر به سیستم واکنش غلظت کمپلکس ES را افزایش میدهد بنابراین سرعت کلی واکنش نیز افزایش می یابد.این پاسخی است بر این مشاهده که سرعت واکنش به طور کلی متناسب با غلظت انزیم موجود در سیستم است و پایه ای است برای اندازه گیری کمی انزیم ها به وسیله اندازه گیری سرعت واکنش .شرایط واکنش طوری گزینش میشوند که اطمینان شود که سرعت واکنش دیده شده در یک بازه تا اندازه ممکن گسترده متناسب با غلظت انزیم باشد.

 

غلظت سوبسترا (substrate concentration)

افزون بر توضیح وابستگی سرعت واکنش به غلظت انزیم تحت شرایطی که سوبسترای مازاد وجود دارد، تشکیل یک کمپلکس ES پاسخی است بر ارتباط هایپربولیک (hyperbolic relationship) بین سرعت واکنش (reaction velocity) و غلظت سوبسترا (substrate concentration) (شکل 15-4).

در این بخش تک سوبسترا (single-substrate)، دو سوبسترا (two-substrate) و واکنشهای انزیمی پی در پی بحث خواهند شد.

 

واکنش های تک سوبسترا (single-substrate reactions)

اگر غلظت انزیم ثابت باشد و غلظت سوبسترا تغییر کند، سرعت واکنش نسبت به غلظت سوبسترا از درجه اول (first order) و متناسب با غلظت سوبسترا در مقدارهای کم انزیم می باشد.تحت این شرایط تنها بخشی از انزیم با سوبسترا مشارکت میکند و سرعت دیده شده نشاندهنده غلظت پایین کمپلکس ES است.در غلظتهای بالای سوبسترا تغییر در غلظت سوبسترا هیچ اثری بر سرعت نداشته و واکنش نسبت به غلظت سوبسترا از درچه صفر (zero order) است.تحت این شرایط همه انزیم ها به سوبسترا متصل بوده و بالاترین سرعت واکنش به دست می اید.دیگر اینکه چون همه انزیم ها به شکل کمپلکس هستند، دیگر افزایشی در غلظت کمپلکس و افزایشی در سرعت واکنش امکان پذیر نیست.بیشترین سرعت ممکن برای واکنش بدست امده است.اهمیت نمودارهای سوبسترا – سرعت اول بار به وسیله میکائیلیس و منتن تاکید شد و چنین نمودارهایی،نمودارهای میکائیلیس – منتن نامیده میشوند.

      با نگاه دوباره به معادله (2) سرعت کلی واکنش (v) به وسیله سرعت تشکیل محصول چنین است.

تشکیل ES بستگی به ثابت سرعت k1 و در دسترس بودن انزیم و سوبسترا دارد.اگر فرض شود که سیستم در حالت پایدار (steady state) که در آن کمپلکس ES با سرعت یکسان تشکیل و شکسته میشود بنابراین غلظت ] ES [ کلی ثابت است و معادله در حالت پایدار چنین خواهد بود.

این معادله را می توان به شکل زیر بازارایی کرد.

هنگامی که این ثابت های سرعت به شکل یک واژه با هم ترکیب شوند ثابت میکائیلیس (Km) به شکل زیر تعریف میشود.

و جایگزین کردن این در معادله (5) معادله زیر را میدهد.

از انجایی که مقدار کل انزیم در سیستم تغییر نمیکند.

و با جایگزینی معادله (3) در معادله (7) و حذف (ES) با استفاده از معادله (8)

برای یک مقدار مفروض از انزیم،بیشینه سرعت واکنش (Vmax) هنگامی بدست می اید که همه انزیم با سوبسترا سیر شود(به عبارت دیگر ] ES [ = ] Et [ و بنابراین Vmax = k2 * [Et]  . با جایگزین کردن این در معادله (9) خواهیم داشت .

یک نمودار از v در برابر ] S [ بخشی از یک نمودار هایپربولیک (شکل 15-4 را ببینید) را میدهد و این شکل نموداری که بطور تجربی برای بیشتر انزیم ها دیده میشود.هنگامی که [s] = Km میتوان با دستکاری معادله (10) نشان داد که Km غلظتی از سوبسترا است که واکنش با نیمی از بیشینه سرعت خود پیش میرود.در عمل اکنون معمول است که Km را به غلظت سوبسترای بطور تجربی تعیین شده که در آن v = 0.5 Vmax  باشد محدود کنند و نماد Ks را برای نشان دادن ثابت تشکیل ES واقعی هنگامی که معلوم باشد استفاده میکنند.

اگر چه ساده است که ازمایشی برپا کرد و تغییرهای v را در برابر ] S [ تعیین نمود اما مقدار دقیق Vmax از نمودار هایپربولیک به اسانی تعیین نمیشود.دیگر این که بسیاری از انزیم ها از رفتار ایده ال ، در غلظتهای بالای سوبسترا منحرف میشوند و به درستی ممکن است به وسیله مازاد سوبسترا مهار گردند بنابراین مقدار محاسبه ای Vmax را نمیتوان در عمل به دست اورد. در گذشته معمول بود که معادله میکائیلیس – منتن (معادله 10) به یکی از شکلهای معکوس (معادله های 11 و 12) تبدیل کنند.یا 1 / v در برابر 1 / [S]  رسم میشد و یا [S] / v   در برابر [S] رسم میشد.

معادله (11) به عنوان نمونه هنگامی که رسم شود نمودار lineweaver – burk را به دست میدهد که یک خط راست شکل میدهد که محور Y ها را در 1 / Vmax و   محور X ها را در  - 1 / Km قطع میکند.به منظور نمایش،داده های شکل 15-4 به شکل لاین ویور- برک در شکل 15-5 دوباره رسم میشوند.

اکنون تعیین ثابتهای کینتیک مانند Km و Vmax با استفاده از بسته های نرم افزاری یک عمل معمول به شمار میرود.شمار زیادی از چنین بسته های نرم افزاری در دسترس هستند،این بسته ها از انواع تخصصی معمول برای شبیه سازی کینتیک یا برای جور سازی داده ها (data fitting) گرفته تا بسته های نرم افزاری برای محاسبه های ریاضی،اماری و یا نموداری می باشند .این بسته ها رایگان هستند یا بصورت تجاری در دسترس میباشند.یکی از اولین نمونه ها ENCORA 1.2 است که توسط slats و همکاران در دانشگاه Delft برای جور سازی پارامترهای کینتیک انزیمی با استفاده از انالیز پیشرونده نمودار طراحی شده است.ِDynaFit یک نمونه از انواع تجاری در دسترس است که رگرسیون غیر خطی کمترین مربع ها (nonlinear least squares regression) را برای کینتیک شیمیایی ،کینتیک انزیمی و یا داده های اتصال لیگاند گیرنده (ligand receptor binding) را انجام میدهد.داده ها میتواند سرعت های واکنش ابتدایی برای غلظتهای مختلف از گونه های متغیر باشد ( به عنوان نمونه غلظت مهار کننده در برابر سرعت ) و یا نمودارهای پیشرفت واکنش ( به عنوان نمونه زمان در برابر جذب ) . sigmaPlot 11 نمونه ای دیگر از نرم افزار تجاری در دسترس است که داده های کینتیک انزیمی را پردازش و نمودار سازی میکند.

مقدار K برای مقایسه اتصال سوبستراهای مشابه یا مرتبط به انزیم یکسان استفاده میشود.همچنین اگر تحت شرایط تعریف شده و سوبسترای یکسان اندازه گیری انجام شود ،مقدار Km میتواند برای مقایسه ویژگی های انزیم های همانند از منابع مختلف استفاده شود.ایزوانزیم هایی که به وسیله لوکوس های ژنتیکی مشخصی تعیین شده اند بطور معمول Km متفاوتی دارند (برای نمونه ایزوانزیم های لاکتات دهیدروژناز را میتوان نام برد).

در هنگام جستجوی روشهای سنجش انزیمی ،لازم است که (1) ارتباط بین سرعت واکنش و غلظت سوبسترا را در یک بازه گسترده کاوش کنید (2) مقدار Km را تعیین نمایید و (3) هرگونه مهار را در غلظتهای بسیار بالای سوبسترا معین کنید .کینتیک های درجه صفر (zero-order kinetics) هنگامی که سوبسترا به اندازه بسیار مازاد وجود داشته باشد برقرار میگردد ( به عبارت دیگر دست کم 10 و بهتر اینکه 100 برابر مقدار مربوط به Km باشد).هنگامی که [S] = 10 * Km باشد آنگاه v تقریبا 91% مقدار Vmax از نظر تئوری خواهد بود.مقدارهای Km برای بیشتر انزیم ها در بازه 10^-5 – 10^-3 mol / L است.بنابراین غلظتهای سوبسترا معمولا از بازه 0.001 – 0.10 mol/L گزینش میشوند.

 گهگاهی غلظتهای مناسب سوبسترا را نمی توان بکار گرفت ( به عنوان نمونه هنگامی که سوبسترا حل پذیری کمی دارد و یا هنگامی که غلظت یک سوبسترای مفروض فعالیت انزیمی دیگر و لازم را در یک سیستم واکنش جفت شده مهار میکند)

 

واکنش های دو سوبسترایی (two-substrate reactions)

بیشتر انزیم ها واکنش هایی را کاتالیز میکنند با دو یا چند سوبسترای واکنش دهنده که در معادله زیر نشان داده شده است.

هنگامی که یکی از سوبستراها آب باشد ( به عبارت دیگر هنگامی که فرایند هیدرولیز است ) و واکنش در محلول آبی رخ دهد تنها یک بخش از همه مولکولهای آب در واکنش شرکت میکند.تغییر کوچک در غلظت آب هیچ اثری بر سرعت واکنش نداشته و این نوع واکنشهای تک سوبسترایی کاذب با کینتیک تک سوبسترایی توصیف میشوند.بطور کلی بیشتر غلظت هر دو سوبسترا ممکن است تغییر کند و هر دو ممکن است بر سرعت واکنش اثر بگذارند.از بین واکنش های دو سوبسترایی مهم در انزیم شناسی بالینی واکنش های کاتالیز شونده توسط دهیدروژنازها است که در آن سوبسترای دوم یک کوانزیم ویژه است ماننده شکلهای اکسید شده یا کاهش یافته نیکوتینامید ادنین دی نوکلئوتید (NADH) و یا نیکوتینامید ادنین دی نوکلئوتید فسفات (NADPH) و انتقال گروه های امین که توسط امینوترانسفرازها کاتالیز میشود.

اگر یک واکنش دو سوبسترایی از طریق تشکیل کمپلکس های ES بینابین به پیش برود طوری که

 

و به دنبال آن

و اگر S1  و S2 در جایگاه های جداگانه روی مولکول انزیم ترکیب شوند،سرعت واکنش طبق معادله زیر بدست می اید.

K1m و K2m مقدارهای Km برای دو سوبسترا و [S1] و [S2] غلظتهای آنها است.K1s ثابت تعادل برای واکنش برگشت بین انزیم و S1 است.اگر معادله بازارایی شود به شکل معکوس دو برابری خواهیم داشت.

نمودار  1 / v در برابر 1 / [S1] یک خط راست میدهد اما شیب خط ( slope) خط و محل تقاطع آن با محور عرض ها وابسته به [S2] غلظت سوبسترای دوم است (شکل 15-6 A) .بطور مشابه نمودار 1 / v در برابر 1 / [S2] خطهای موازی است اما شیب و محل تقاطع با محور عرض ها وابسته به [S1] است.

مقدارهای Km و Vmax برای هر سوبسترا از آزمایش ها طوری گرفته میشود که در آن غلظت سوبسترای اول در مقدار اشباع ،ثابت گرفته میشود درحالی که غلظت سوبسترای دوم تغییر میکند و همین طور بر عکس.هیچ دلیلی وجود ندارد که چرا مقدارهای Km برای دو سوبسترا باید یکسان و یا حتی همانند باشند ( به عنوان نمونه pyruvate و NADH دو سوبسترای جفت در واکنش کاتالیز شده توسط لاکتات دهیدروژناز قلب گاو است که مقدارهای Km 2*10^-5  و 3*10^-6 مول بر لیتر به ترتیب میباشد).

در برخی واکنش های دو سوبسترایی هیچ کمپلکس سه تایی ES1S2 شکل نمیگیرد چون پس از اتصال سوبسترای اول محصول اول رها میشود پیش از آنکه سوبسترای دوم متصل و محصول دوم ازاد شود ، این نوع ترتیب واکنش به عنوان واکنش ping-pong bi-bi شناخته میشود.این نوع واکنش توسط امینوترانسفراز ها کاتالیز میشود.

ارتباط بین سرعت واکنش و غلظتهای دو سوبسترا در واکنش های ping-pong bi-bi  را به شکل خلاصه زیر میتوان نشان داد.

معادله معکوس v در برابر [S1] در معادله زیر نمایش داده شده است .

به این صورت نمودار 1/v در برابر 1/[S1] با تغییر در [S2] شیب آن تغییر نمیکند،اما محل تقاطع در محور عرض ها و بنابراین مقدار Vmax با تغییر [S2] تغییر میکند.(شکل 15-6 B را ببینید)معادله های مشابهی تغییر Vmax با [S1] را هنگامی که 1/v در برابر 1/[S2] رسم شود ،بیان میکند.

انتخاب شرایط واکنش برای اندازه گیری فعالیت انزیمی با دو سوبسترا، بطور تجربی با تغییر غلظت سوبسترای اول و ثابت نگه داشتن غلظت سوبسترای دوم تا رسیدن به بیشینه فعالیت صورت میگیرد.این فرایند آنگاه با ثابت نگه داشتن غلظت سوبسترای اول در مقدار مورد نظر و تغییر در غلظت سوبسترای دوم تکرار میگردد.

در عمل گزینش غلظتهای سوبستراها محدود به نظرداشت هایی همچون حل پذیری سوبستراها،چسبندگی (viscosity) و جذب اغازین محلول های غلیظ و هزینه نسبی ریاجنتها می باشد.دیگر اینکه گزینش غلظتهای مناسب سوبسترا تنها یکی از عامل هایی است که باید در فرمولیزه کردن یک سیستم مناسب برای اندازه گیری فعالیت یک انزیم خاص در نظر گرفت .گزینش های مهم دیگر نیز باید در ارتباط با دیگر عاملهای مهم به هم وابسته که بر سرعت واکنش اثر میگذارند گرفته شود مانند غلظت فعال کننده ها (activators) و ماهیت pH و سیستم بافری .

 

واکنشهای انزیمی پی در پی (consecutive enzymatic reactions)

همانطور که پیشتر گفته شد ،واکنشهای انزیمی معمولا به یک سمت با سرعت بیشتری پیش می روند تا به سمت دیگر طوری که واکنش در اصل برگشت ناپذیر به حساب می اید.اگر محصول یک واکنش در یک سمت همانطوری که تشکیل میشود ،برداشت گردد (به عبارت دیگر چون سوبسترای یک انزیم دوم در مخلوط واکنش است)،تعادل فرایند انزیمی اول جابجا میشود طوری که واکنش تا کامل شدن به آن سمت پیش میرود.واکنش های زنجیری طوری که محصول یک واکنش کاتالیز شده به وسیله انزیم سوبسترای انزیم دیگر میشود و بیشتر از طریق چندین مرحله انجام میگردد از ویژگی های فرایندهای متابولیک است. از نظر انالیز همانطور که پیشتر گفته شد چندین واکنش انزیمی ممکن است به همدیگر بپیوندند تا وسیله ای برای اندازه گیری فعالیت انزیم اول یا غلظت سوبسترای اغازین در زنجیر فراهم گردد.

هنگامی که یک سنجش انزیمی پیوسته که به عنوان واکنش شاخص (indicator reaction) نام برده میشود برای تعیین فعالیت یک انزیم دیگر بکار برده میشود،لازم است که واکنش اصلی مرحله محدود کننده سرعت (rate-limiting step) باشد.برای نمونه در تعیین فعالیت اسپارتات امینوترانسفراز واکنش شاخص ،کاهش 2-oxoglutarate تشکیل شده در واکنش امینوترانسفراز به malate است که توسط مالات دهیدروژناز (malate dehydrogenase) و NADH انجام میشود.فعالیت انزیم شاخص باید کافی باشد تا از برداشت سریع محصول واکنش اول اطمینان حاصل شود و همچنین از بازگشت واکنش اول پیشگیری گردد.انزیم اندازه گیری شده تحت شرایط اشباع از نظر سوبسترای خود عمل میکند با این حال غلظت سوبسترای شاخص ( به عبارت دیگر محصول واکنش اول ) در ناحیه منحنی میکائیلیس-منتن میماند بطوری که v بطور مستقیم متناسب با [s] است.بنابراین سرعت واکنش کاتالیز شده توسط انزیم شاخص بطور مستقیم متناسب با سرعت محصول تشکیل شده در واکنش اول.

در طی دوره Lag که پس از اغاز واکنش اول رخ میدهد غلظت محصول آن به حالت پایدار (steady state) میرسد.از انجایی که سرعت واکنش دوم بستگی به فعالیت انزیم شاخص و بستگی به غلظت سوبسترای آن ( محصول واکنش اصلی) دارد ،مدت دوره Lag با افزایش غلظت انزیم شاخص کاهش می یابد و بنابراین غلظت حالت پایدار محصول واکنش اصلی نیز پایین میاید.

سرعت واکنش شاخص ،vi ، در ارتباط با غلظت سوبسترا و بنابراین مرتبط با غلظت محصول [P] طبق معادله میکائیلیس – منتن است.

که در آن Vimax و Kim  به ترتیب سرعت بیشینه و Km  برای انزیم شاخص است.برای اینکه سرعت واکنش اندیکاتور عامل محدود کننده سرعت نباشد vi باید دست کم برابر با سرعت محدود کننده واکنش اصلی ،Vt ، باشد که سیستم سنجش انتظار میرود آن را اندازه گیری نماید.بنابراین کمترین فعالیت انزیم اندیکاتور که نیاز است از رابطه زیر بدست میاید.

یا اگر بازارایی شود

نسبت فعالیت های انزیم اندیکاتور و انزیم اصلی از یک روش سنجش تا روشی دیگر فرق میکند و بستگی دارد به (1) گستره فعالیتی که اندازه گیری میشود (2) Km انزیم اندیکاتور (3) دوره Lag ی که قابل پذیرش است. با این حال غلظت کاتالیزی انزیم اندیکاتور در مخلوط واکنش باید همیشه بسیار بیشتر از غلظت کاتالیزی انزیمی باشد که اندازه گیری میشود.

 

اثر pH (effect of pH)

اثر واکنش های کاتالیز شده به وسیله انزیم بطور معمول یک وابستگی چشمگیری نسبت به pH نشان میدهد (شکل 15-7).

بسیاری از انزیم های پلاسمای خون بیشترین فعالیت خود را در شرایط ازمایشگاهی در گستره pH از 7 تا 8 نشان میدهند.با این حال فعالیت های دیده شده در مقدارهای pH بسیار پایین به اندازه 1.5 (pepsin) و به بزرگی 10.5 (ALP) دیده شده است.pH مناسب برای یک واکنش مفروض رو به جلو (forward) ممکن است متفاوت از pH مناسب برای واکنش برگشت مربوط (reverse) باشد.شکل نمودار وابستگی به pH نتیجه شماری از عوامل جداگانه است شامل یونیزه شدن سوبسترا و گستردگی مشارکت ناپذیری (dissociation) برخی زنجیرهای کناری امینواسیدها در مولکول پروتیین ،هم در جایگاه فعال و هم در دیگر جایگاه های مولکول.هر دوی pH و محیط یونی بر شکل سه بعدی پروتیین اثر دارند و بنابراین روی فعالیت انزیم هم تا اندازه ای اثر دارند که انزیم ممکن است بطور برگشت ناپذیر در مقدارهای بیش از اندازه pH دناتوره گردد.

اثر گفته شده pH روی واکنش های انزیم تاکید میکند که به کنترل این متغیر به وسیله محلول های بافری کافی نیاز است.سنجش های انزیمی باید در pH با فعالیت مناسب انجام شود،زیرا نمودار فعالیت – pH (pH – activity curve) نزدیک این pH کمترین شیب (slope) خود را دارد و تغببر کوچک در pH سبب تغییرهای کمی در فعالیت انزیم میگردد.سیستم بافر باید توانایی برخورد با اثر افزودن نمونه ( به عنوان مثال سرم به تنهایی یک بافر توانا است) به سیستم سنجش را داشته باشد علاوه بر آنکه با اسیدها و بازهای تشکیل شده طی واکنش نیز مقابله میکند(به عنوان نمونه تشکیل اسیدهای چرب به وسیله عملکرد لیپاز).از انجایی که بافرها بیشینه توانایی بافر کردنشان نزدیک به مقدارهای pKa آنها است هرگاه امکان داشته باشد یک سیستم بافری باید طوری گزینش شود که pKa سیستم بافر کننده درون 1 واحد pH از pH مطلوب سنجش باشد(فصل 11 را ببینید) .برهم کنش بین یونهای بافر و دیگر اجزای سیستم سنجش (به عنوان نمونه یونهای فلزی فعال کننده) ممکن است سبب کنار گذاشتن برخی بافرها به عنوان سیستم بافری گردد.

 

دما (temperature)

سرعت واکنش انزیمی متناسب با دمای واکنش است.برای بیشتر واکنش های انزیمی مقدار Q10 (نسب سرعت های واکنش در دو دما که 10 c اختلاف دارند) از 1.7  تا  2.5 فرق میکند.با این حال افزایش در سرعت واکنش کاتالیز شده تنها اثر افزایش دما بر یک واکنش انزیمی نیست.در تئوری سرعت اغازین واکنش که بی درنگ اندازه گیری شده با افزایش دما افزایش می یابد.در عمل با این حال یک زمان قطعی لازم است تا اجزای مخلوط واکنش به همراه محلول انزیم به تعادل دمایی (temperature equilibrium) برسند و نیز مقدار محصول به اندازه قابل سنجش برسد.طی این دوره انزیم متحمل غیر فعال شدن دمایی و دناتوراسیون میشود،فرایندی که یک ضریب دمایی بسیار بزرگی برای بیشتر انزیم ها دارد و در پایان در دمای 60 تا 70 درجه سانتی گراد بطور خود بخوردی غیر فعال میشوند.اثرهای مخالف سرعت واکنش کاتالیز شده و غیر فعال شدن بسیار سریع انزیم همینطور که دما افزایش پیدا میکند دلیل بر وجود یک دمای مناسب اشکار (apparent optimal temperature) برای فعالیت انزیمی است(شکل 15-8).

همانطور که پیشتر گفته شد در برخی دماهای بحرانی انزیم متحمل غیرفعال شدن دمایی میشود که تحت تاثیر شماری از عوامل است.این ها شامل سوبسترا و غلظت آن ،pH و ماهیت و قدرت یونی بافر است.وجود دیگر پروتیین ها همانطور که در نمونه های سرمی وجود دارد ممکن است به پایداری انزیم ها کمک کند.نگه داری نمونه های سرمی در دماهای پایین برای کم کردن افت فعالیت انزیمی تا زمان انجام انالیز لازم است اگرچه از ذوب و فریز مکرر باید پرهیز شود.با این حال انزیم ها در ویژگی های پایداری خود متفاوت هستند و شرایط نگه داری مناسب برای هر کدام فرق میکند.امیلاز به عنوان نمونه در دمای اتاق به مدت 24 ساعت پایدار است در حالی که اسید فسفاتاز بی اندازه ناپایدار است حتی هنگامی که در یخچال نگه داری شود مگر اینکه در pH زیر 6 نگه داری شود.ALP یک ویژگی غیرعادی از خود نشان میدهد:تمایل برای افزایش فعالیت انزیم فریز شده و بطور جزیی تخلیص شده پس از ذوب شدن در طی 24 ساعت و یا بیشتر.این اثر در فراورده های لیوفیلیزه دوباره بازسازی شده دیده میشود و کاربرد انها را برای منظورهای کنترل کیفی تحت تاثیر قرار میدهد.انزیم های کمی هم در دماهای یخچال غیرفعال میشوند که نمونه مهم بالینی آن ایزوانزیم نوع کبدی لاکتات دهیدروژناز ،LD5، است که به نظر میرسد در دماهای پایینتر کمتر پایدار باشد.در نتیجه سرمها برای اندازه گیری لاکتات دهیدروژناز باید در دمای اتاق نگه داری شوند و نه در یخچال.

از نظر تاریخی گزینش دما برای سنجش انزیم های با اهمیت بالینی یکی از مهمترین موارد کشمکش ها بوده است.گزینش دمای واکنش اکنون بی اهمیت شده است چون بیشتر سیستم های انالیزی در دمای 37 درجه سانتی گراد عمل میکنند.روشهای رفرانس (روشهای مرجع ) برای چند انزیم با اهمیت بالینی اکنون در 37 C طراحی شده اند.در عمل کنترل درست دما با تغییر

0.1 C  در طی واکنش انزیمی ضروری است.

 

مهار کننده ها و فعال کننده ها (inhibitors and activators)

سرعت واکنش های انزیمی اغلب به وسیله موادی غیر از انزیم و سوبسترا تحت تاثیر قرار میگیرد.این تغییر دهنده ها ممکن است مهار کننده (inhibitors) باشند چون حضور آنها سرعت واکنش را کاهش میدهد و یا فعال کننده (activators) باشند چون سرعت واکنش را افزایش میدهند.فعال کننده ها یا مهار کننده ها معمولا مولکولهای کوچکی ( در برابر خود انزیم ها ) هستند و یا حتی یون باشند.آن ها در اختصاصیت (specificity) فرق دارند از تغییر دهنده هایی که اثرهای همانندی را روی طیف گسترده ای از واکنش های انزیمی مختلف اعمال میکنند گرفته تا موادی که تنها بر یک واکنش یکتا اثر می گذارند.ریاجنت هایی مانند اسیدهای قوی یا انیون ها و کاتیون های چند ظرفیتی که پروتیین ها را دناتوره یا رسوب میدهند فعالیت انزیمی را نابود کرده و به عنوان نمونه هایی از مهار کننده های انزیمی غیر اختصاصی به شمار میروند.فعالیت برخی انزیم ها بستگی به وجود گروه های شیمیایی ویژه ای مانند سولفیدریل کاهش یافته (- SH) در جایگاه فعال خود دارند.ریاجنت هایی که این گروه ها را تغییر میدهند (مانند اکسید کننده های گروه های SH) بنابراین به عنوان مهارکننده های عمومی چنین انزیم هایی به شمار میروند.

برخی پدیده های فعال کنندگی یا مهار کنندگی انزیمی به وسیله برهم کنش بین یک تغییر دهنده (modifier) و یک بخش غیر انزیمی سیستم واکنش مانند سوبسترا ایجاد میشود (مانند Mg2+ که با ATP ترکیب میشود تا MgATP را تشکیل بدهد که سوبسترای لازم برای واکنش کراتین کیناز است).در بیشتر موارد با این حال تغییر دهنده (modifier) با خود انزیم به شیوه ای شبیه به ترکیب انزیم و سوبسترا ترکیب میگردد.

 

مهار فعالیت انزیم (inhibition of enzyme activity)

مهار کننده ها به دو گونه برگشت پذیر و برگشت ناپذیر  دسته بندی میشوند.مهار برگشت پذیر به این اشاره دارد که فعالیت انزیم هنگامی که مهار کننده از سیستمی که انزیم در آن عمل میکند به وسیله فرایندهای جداکننده فیزیکی مانند دیالیز (dialysis) ،ژل فیلتراسیون (gel filtration)، و یا کروماتوگرافی (chromatography) برداشته شود ، باز خواهد گشت.یک مهارکننده برگشت ناپذیر بطور کووالانسی با انزیم ترکیب میشود طوری که روشهای فیزیکی در جدا کردن آن دو کارامد نباشد.برای نمونه ترکیبات ارگانوفسفر (organophosphorous) بی اندازه مهارکننده های برگشت ناپذیر توانمندی برای استرازها به ویژه استیل کولین استراز هستند.انزیم یکی از پیوندها در مهارکننده را میشکند اما بخشی از مولکول در جایگاه فعال متصل باقی میماند و انزیم را از فعالیت بیشتر باز میدارد.در برخی موارد انزیم هایی که با مهارکننده های برگشت ناپذیر ترکیب شده اند میتوان آنها را به وسیله واکنشهای شیمیایی که گروه مسدود کننده را حذف میکند ( مانند انزیم های فسفریله شده با ترکیب های ارگانوفسفر که میتوان آنها را با تیمار با اکسیم (oximes) و یا هیدروکسامیک اسید (hydroxamic acid) دوباره فعال کرد) دوباره فعال کرد.

 

 مهار برگشت پذیر (revesible inhibition)

مهار برگشت پذیر دارای ویژگی تعادل بین انزیم ،E ، و مهار کننده ،I، است.

ثابت تعادل واکنش ،Ki ( ثابت مهارکننده ) سنجشی است از میل ترکیبی (affinity) مهار کننده برای انزیم درست همانند Km که بازتاب دهنده میل ترکیبی انزیم برای سوبسترایش است.

یک مهارکننده رقابتی معمولا یک همسان ساختاری (structural analog) سوبسترا است که میتواند با انزیم ازاد طوری ترکیب شود که با سوبسترای طبیعی بر سر اتصال به جایگاه فعال انزیم رقابت کند.سرعت واقعی واکنش کاملا وابسته به نسبت غلظت سوبسترا به مهارکننده است.بنابراین دو تعادل را متوان تصور کرد.

و

معادله ای که سرعت واکنش دیده شده را در ارتباط با غلظتهای سوبسترا ] S [ و مهارکننده ] I [ نشان میدهد به صورت زیر است.

این همان معادله میکائیلیس – منتن است اما با این تفاوت که Km با واژه ای اصلاح شده است که عبارت است از غلظت مهارکننده و ثابت مهارکننده ، Vmax بدون تغییر است.بنابراین منحنی های v در برابر ] S [ در حضور و غیاب مهارکننده به مقادیر یکسان محدود کننده در غلظتهای بالای سوبسترا میرسند اما هنگامی که مهارکننده وجود دارد Km به نظر بزرگتر میرسد.نمودارهای 1/v در برابر 1/[S] با و بدون مهارکننده محورها را در همان نقاط قطع میکند اما شیب ها (slope)ی متفاوت

و نقاط متفاوت تقاطع روی محور طول ها دارد.(شکل 15-9).

مهار رقابتی مسوول مهار برخی انزیم ها به وسیله سوبسترای مازاد (excess substrate) است زیرا رقابت بین مولکولهای سوبسترا بر سر یک جایگاه اتصال تک رخ میدهد.در واکنش های دو سوبسترایی غلظتهای بالای سوبسترای دوم ممکن است با اتصال سوبسترای اول رقابت کند.برای نمونه اسپارتات امینوترانسفراز به وسیله غلظت مازاد 2- oxoglutarate به عنوان سوبسترا مهار میشود و این مهار نسبت به L-aspartate رقابتی است.بنابراین برای برقراری یک سرعت مفروض در غلظتهای بالای 2-oxoglutarate باید غلظت L-aspartate به مقدارهای باالای مورد نیاز از غلظت 2-oxoglutarate افزایش یابد.

مهار رقابتی همچنین در کاهش سرعت واکنش انزیمی در گذر زمان دخالت دارد.برای نمونه کاهش سرعت بخاطر غلظت های افزایش یابنده محصول واکنش میتواند رخ دهد و واکنش به سمت عقب برگردد به ویژه اگر به اسانی برگشت پذیر باشد.یک محصول (product) ممکن است خودش مهارکننده واکنش رو به جلو باشد حتی اگر واکنش به اسانی برگشت پذیر نباشد بنابراین واکنش به سمت مخالف غلظتهای افزایش یابنده مهارکننده پیش میرود.یک نمونه اشنا از مهار توسط محصول رها شده مهارکننده رقابتی ،فسفات غیرآلی ، به وسیله واکنش ALP روی سوبسترایش است.در این مورد هم فسفات های آلی و هم فسفات های غیرآلی به جایگاه فعال انزیم با میل ترکیب های همانند متصل میشوند (به عبارت دیگر Km و Ki دارای بزرگی یکسانی هستند).

مهار توسط محصول یک علت غیر خطی بودن منحنی پیشرفت واکنش در روش زمان-ثابت (fixed-time methods) در سنجش انزیم ها است.برای نمونه oxaloacetate تولید شده به وسیله واکنش اسپارتات امینوترانسفراز ،انزیم را مهار میکند به ویژه ایزوانزیم میتوکندریایی را .مهار کنندگی محصول میتواند به وسیله یک واکنش انزیمی جفت شده برداشته شود:مالات دهیدروژناز oxaloacetate را به malate تبدیل میکند و در همان زمان NADH را به NAD+ اکسید میکند.

مهار رقابتی به وسیله یونهای فلزی هنگامی رخ میدهد که دو یون فلزی بر سر یک جایگاه اتصال یکسان روی انزیم رقابت کنند.سدیم و لیتیوم مهار کننده های توانمندی برای پیرووات کیناز (pyruvate kinase) هستند که پتاسیم یک فعال کننده الزامی برای آن به شمار میرود.

یک مهارکننده غیر رقابتی (noncompetitive inhibitor) معمولا از نظر ساختار متفاوت از سوبسترا است.گمان بر این است که یک مهار کننده غیر رقابتی به یک جایگاهی روی مولکول انزیم متصل میشود که متفاوت از جایگاه اتصال سوبسترا است بنابراین هیچ رقابتی بین مهار کننده و سوبسترا نیست و یک کمپلکس سه تایی انزیم – سوبسترا – مهارکننده (ESI) شکل میگیرد.چسبیدن مهارکننده به انزیم تغییری در میل ترکیبی انزیم به سوبسترایش ایجاد نمیکند( به عبارت دیگر Km بدون تغییر باقی میماند) اما کمپلکس ESI شکسته نشده و محصولی تمیدهد.از انجایی که سوبسترا با مهارکننده بر سر جایگاه اتصال روی مولکول انزیم رقابت نمیکند ،افزایش غلظت سوبسترا بر مهارکننده غیر رقابتی تاثیری ندارد.بنابراین Vmax در حضور یک چنین مهارکننده ای کاهش می یابد در حالی که Km تغییر نمیکند همانطور که نمودار lineweaver-burk نشان میدهد (شکل 15-9 را ببینید).

 

مهار نارقابتی (uncompetitive inhibition) به وسیله ترکیب مهارکننده با کمپلکس ES ایجاد میشود.این نوع مهار بیشتر در واکنش های دو سوبسترایی رخ میدهد که در آن کمپلکس سه تایی ESI پس از اینکه اولین سوبسترا با انزیم ترکیب شد،تشکیل میگردد. در مهار نارقابتی خطهای موازی هنگامی که نمودار 1/v در برابر 1/[S] رسم شود با و بدون حضور مهارکننده با یکدیگر مقایسه شده اند (شکل 15-9 را ببینید)،که هم Km و هم Vmax هر دو کاهش یافته اند.

 

مهار برگشت ناپذیر (irreversible inhibition).مهار کننده های برگشت ناپذیر با اتصال کووالانسی و تغییر همیشگی یک گروه عملکردی لازم برای کاتالیز مولکول انزیم را غیر فعال میکنند.یک مهار کننده برگشت ناپذیر با مولکول انزیم تعادل برقرار نمیکند.اثر آن در گذر زمان پیشرونده است و اگر مقدار مهارکننده فراتر از مقدار کل انزیم باشد،مهار انزیم کامل میشود.سرعت واکنش بین انزیم و مهار کننده به صورت بخشی از فعالیت انزیم که در یک زمان ثابت و به وسیله یک غلظت معین از مهار کننده ،مهار شده است بیان میگردد.ثابت سرعت واکنش مهارکننده با انزیم سنجشی است برای کارایی مهار کننده.

هنگامی که مهارکننده به انزیم در حضور سوبسترایش افزوده میشود ،واکنش بین انزیم و مهارکننده ممکن است با تاخیر رخ دهد و این بخاطر این است که برخی از مولکولهای انزیم با سوبسترا ترکیب شده اند و از واکنش با مهارکننده به دور میمانند.با این حال همینکه مولکولهای سوبسترا بصورت شیمیایی واکنش میدهند،جایگاه های فعال در دسترس قرار گرفته و در پایان مهار کامل میشود حتی اگر سوبسترای مازاد در اغاز وجود داشته باشد. دیگر اینکه افزودن سوبسترای بیشتر در برگرداندن مهار بی تاثیر است برخلاف اثر مهار رقابتی برگشت پذیر آن.

مهارکننده های برگشت ناپذیر در نقشه برداری از جایگاه های فعال به وسیله تغییر کووالانسی که در گونه های مختلف گروه های عملکردی مولکول انزیم ایجاد میکنند بکار گرفته شده اند تا مشخص گردد که چه گروه هایی برای فعالیت کاتالیزی لازم است.

یک دسته مهم از مهار برگشت ناپذیر انزیم از نظر فیزیولوژیکی مهارکننده های مختلف تریپسین است .این ها پروتیین هایی هستند که به تریپسین بطور برگشت ناپذیر متصل میشوند و فعالیت پروتئولیزی آن را خنثی میکنند.یک چنین مهارکننده ای در بخش α1-globulin پروتیین های سرم وجود دارد ،دیگر مهارکننده ها سویا و لوبیای لیما یافت میشوند.مهارکننده های فعالیت پروتئولیزی مشابه در پلاسما وجود داشته و از انباشت مازاد ترومبین (thrombin) و دیگر انزیم های لختگی (coagulation) پیشگیری کرده و فرایند لختگی را کنترل میکنند.

 

مهار به وسیله انتی بادی ها (inhibition by antibodies)

ترکیب مولکولهای انزیم با انتی بادی هایی خاص اغلب هیچ اثری بر فعالیت کاتالیزی نداشته و تنها یک کمپلکس انزیم – انتی بادی بر جای میماند. با این حال در برخی موارد واکنش انزیم و انتی بادی فعالیت انزیمی را کاهش یا از بین میبرد.بهترین توضیح در این نوع مهار این است که مولکول انتی بادی به وسیله ممانعت فضایی دسترسی مولکولهای سوبسترا را به جایگاه فعال محدود میکنند و یا در بیشتر موارد جایگاه اتصال سوبسترا را بطور کامل میپوشانند.با این حال به نظر میرسد که در برخی موارد مهار انزیم با ترکیب با انتی بادی از طریق تغییر فضایی القا شده در مولکول انزیم انجام میشود.

مهار فعالیت یک مولکول انزیم که با یک هاپتن (به عنوان نمونه morphine) نشاندار شده است در نتیجه ترکیب با یک انتی بادی اختصاصی پایه ای برای انزیم ایمونواسی همگون (homogeneous enzyme immunoassay) را فراهم میکند.

 

فعال سازی انزیم (enzyme activation)

فعال کننده ها (activators) سرعت واکنش های کاتالیز شده توسط انزیم ها را از طریق تشکیل بیشترین حالت فعال خود انزیم و یا دیگر واکنشگرها مانند سوبسترا افزایش میدهند.این تعمیم چندین مکانیسم فعال سازی را پوشش میدهد.

بسیاری از انزیم ها دارای یونهای فلزی به عنوان بخشی از ساختار درونی خود هستند (به عنوان نمونه فلز روی ،Zinc، در ALP و carboxypeptidase A).عملکرد فلز ممکن است در پایدارسازی ساختار سوم و یا چهارم پروتیین باشد.برداشت یونهای فلزی دو ظرفیتی به وسیله یک مقدار مناسب اتیلن دی امین تترا استیک اسید(EDTA) با تغییر فضایی و غیرفعال سازی انزیم همراه است.انزیم اغلب میتواند به وسیله دیالیز در برابر یک محلول که دارای یون فلزی مناسب است و یا به روش اسان تر با افزودن یون فلزی به مخلوط واکنش دوباره فعال کرد.باز فغال سازی ممکن است کمی زمان ببرد چون بازارایی زنجیر پلی پپتید به حالت فضایی فعال بی درنگ انجام نمیشود.

هنگامی که یون فعال کننده یک بخش ضروری از مولکول انزیم باشد، خواه یک عنصر فقط ساختاری باشد و خواه با یک نقش اضافی کاتالیزی معمولا بسیار محکم درون مولکول انزیم جای گرفته است.بنابراین معمولا لازم نیست که فعال کننده را به مخلوط واکنش بیفزایید و مازاد یون فلزی ممکن است حتی یک اثر مهارکنندگی هم داشته باشد.با این حال در برخی موارد یون فعال کننده بطو ضعیف و یا گدرا به انزیم (و یا سوبسترا ) در طی کاتالیز میچسبد.بنابراین نمونه های انزیم ممکن است کمبود یون فلزی داشته باشند بطوری که افزودن یون بر سرعت واکنش می افزاید و به درستی که ممکن است برای اینکه وااکنش رخ دهد ضروری باشد.برای نمونه ، همه انزیم های انتقال دهنده فسفات (kinases) مانند کراتین کیناز(creatine kinase) به وجود یونهای Mg2+ نیاز دارند.دیگر کاتیون های فعال کننده معمول Mn2+ , Fe2+ , Ca2+ , Zn2+  و K+ هستند. و دیگر اینکه خیلی کمیاب انیون ها ممکن است به عنوان فعال کننده ها عمل کنند.امیلاز (amylase) تنها اگر Cl- (یون کلراید) و یا دیگر انیون های تک ظرفیتی مانند Br- یا NO3- وجود داشته باشند با بیشترین سرعت خود کاتالیز میکنند.افزودن کلراید  5 mmol / L فعالیت امیلاز را نزدیک به سه برابر در زمانی برابر و با میل دادن pH مناسب از 6.5 به 7.0 ،افزایش میدهد.یون کلراید ممکن است با گروه های باردار مثبت ترکیب شده و ثابت یونیزاسیون یک گروه مهم در کاتالیز را تغییر دهد.با این حال دیگر انیون ها مانند بروماید فعال کننده های کمتر موثری برای امیلاز هستند و بنابراین مقداری اختصاصیت در فرایند فعال سازی وجود دارد.برخی انزیم ها نیازمند وجود اجباری دو یون فعال کننده هستند. K+ و Mg2+ برای فعالیت پیرووات کیناز و Mg2+ و Zn2+ برای فعالیت ALP ضروری هستند.

سرعت واکنش بستگی به غلظت فعال کننده برگشت پذیر (reversible activator) به شیوه ای همانند وابستگی آن به غلظت سوبسترایش دارد و یک ثابت فعال کننده (activator constant= Ka) همانند Km را میتوان از داده هایی که فعالیت انزیم را به غلظتهای افزاینده فعال کننده ربط میدهد در حضور سوبسترای مازاد، تعیین کرد.ساده ترین تفسیر Ka ، آن است که ثابت تفکیک تعادل بین E و فعال کننده A است.با این حال این هنگامی درست است که ترکیب انزیم و فعال کننده غیر وابسته به واکنش بین E و S باشد.و مقدار یکسانی برای Ka در همه غلظتهای سوبسترا بدست اید.اگر انزیم ازاد و کمپلکس انزیم – سوبسترا میل ترکیبی متفاوتی برای فعال کننده داشته باشند ،مقدار Ka با غلظت ] S [ تغییر میکند.

فعال شدن اشکار یک انزیم ممکن است در هنگام افزودن یک ماده مقابله کننده با برخی مهار کننده ها دیده شود.

 

کوانزیم ها و گروه های پروستتیک (coenzymes and prosthetic groups)