الکتروفورز (electrophoresis) - بخش سوم
الکتروفورز (electrophoresis) - بخش سوم
میکروچیپ الکتروفورز (microchip electrophoresis)
طی یک دهه گذشته میکروچیپ الکتروفورز تحول های بنیادینی را به خود دیده است در 1) طراحی های میکروچیپ مجتمع 2) سیستم های آشکار ساز پیش رفته 3) کابردهای جدید. در حوزه تشخیص بالینی ،آنالیتهای عمده مورد جستجو در قالب میکروچیپ پروتیین ها و DNA هستند.
از میان ویژگی های جداسازی با میکروچیپ الکتروفورز میتوان به سرعت بالای آن – به طور طبعی چهار تا ده برابر سریعتر از الکتروفورز مویین معمولی است و حداقل چندین برابر سریعتر از روشهای ژل های ورقه ای (slab gel) است.دیگر برتری های میکروچیپ الکتروفورز شامل 1) سادگی 2) توانایی در مجتمع کردن میکروچیپ ها با چندین عملکرد و 3) توانایی در خودکار شدن آن است.
دستگاهی کردن (instrumentation)
اگرچه در اصول شبیه به همتای الکتروفورز مویین خود است اما از نظر دستگاهی سیستم میکروچیپ از آن متفاوت است.برای نمونه در روش میکروچیپ 1) کانالهای جداسازی 2) کانالهای تزریق نمونه 3) مخزن ها 4) آماده سازی نمونه و یا 5) ری اکتورهای های پیش یا پس از ستون (precolumn or postcolumn reactors) همه روی یک سطح میکروچیپ با بکارگرفتن فرایندهای فوتولیتوگرافیک ساخته میشوند.طرح T متقاطع (cross-T design) کلاسیک از یک میکروچیپ تک کانال شامل یک کانال (تزریق) کوتاه است که کانال (جداسازی) بلندتر را را قطع میکند و شامل یک مخزن در انتهای هر یک از آنها است که در شکل 12-9 نشان داده شده است.ساختار آشکارسازی بر پایه فلورسانس القایی با لیزر (laser-induced fluorescence=LIF) در یک میکروچیپ تک کانال در شکل 12-10 نشان داده شده است.
هنگامی که حجم مورد نیاز برای پر کردن ساختار میکروچیپ مقایسه میشود ، درمیابیم که حجم کانال جداسازی روی میکروچیپ چندین برابر کوچکتر (جند نانولیتر) از سیستمهای الکتروفورز مویین معمولی است.با این نیازهای حجمی گفته شده (نانولیتر و حتی در بازه پیکولیتر) تزریق با فشار بسیار چالش زا است ( اما ناممکن نیست) و تزریق نمونه به روش الکتروکینتیک روش اصلی است.در عمل یک ولتاژ تزریق چندین صد ولتی بر نمونه و مخزنهای ضایعات نمونه بکار برده میشود تا نمونه را به تقاطع تزریق ببرد که این تزریق معادل حجمی از 50 تا 100 پیکولیتر است.یک ولتاژ جداسازی (1-4 kV) در کانال جداسازی بکار برده میشود .چنین ولتاژی سبب جداسازی زون های انالیت میشود پیش از اینکه به پنجره آشکارسازی (detection window) در پایین دست کانال جداسازی برسند.شایان ذکر است اگر چه حجم نمونه تزریق شده 100-500 pL است اما حجم نمونه واقعی مورد نیاز 2-4 uL است بسته به اندازه مخزن.
آشکارسازی در میکروچیپ بطور عمده با LIF انجام میشود چون این نوع آشکارسازی با پیکربندی مسطح میکروچیپ سازگار است (شکل 12-10 را ببینید).حد تشخیص برای فلوئور های فلورسئین مانند ثابت شده که به اندازه 10^-11 mol و حتی به اندازه 10^-13 mol بوده است ،جرم تشخیصی برابر با چند صد مولکول.زمان جداسازی میکروچیپ های معمولی از 50 تا 200 ثانیه است.
تشخیص مولکولی با میکروچیپ ها (molecular diagnostics using microchips)
بدلیل آسان بودن روش که در آن DNA دو رشته ای ، به وسیله درج شونده (intercalator) های فلورسنت DNA دو رشته ای دارای میل ترکیبی بالا (high affinity dsDNA fluorescent intercalators) ، فلورسانس نشان میدهند و حساسیت تشخیصی بسیار عالی که از LIF بدست میاید، جداسازی DNA در میکروچیپ ها بسیار سریعتر از جداسازی پروتیین ها پیش رفته است.
در نهایت اینکه الکتروفورزهای نوع لوله مویین و میکروچیپ به عنوان یک گزینه با هم یکی شده اند تا جایگزین الکتروفورز از نوع slab gel سنتی ، در آنالیز DNA باشند.این توانایی در تعیین توالی ژنوم انسان به وسیله جداسازی برپایه الکتروفورز مویین اهمیت ویژه پیدا میکند.شماری از پلیمرها به عنوان ماتریکس های غربالگر تعریف شده اند که در غربال مولکولی و جداسازی DNA برپایه اندازه و به وسیله میکروچیپ استفاده شده اند.
همانطور که در بخش الکتروفورز مویین توضیح داده شد ماهیت شیمیایی سطح میکروکانال در مورد جداسازی DNA نیز مهم است به ویژه در جریان الکترواسموتیک که باید کاهش یافته یا حذف شود.برای انالیز الکتروفورزی DNA بر پایه میکروچیپ ، سطح چیپ باید غیرفعال شود تا جریان الکترواندواسموتیک کاهش یابد.این هدف از طریق اصلاح کووالانسی با پلیمرهایی مانند پلی اکریلامید انجام میشود. پلیمرهای جذابتری برای الکتروفورز مویین طراحی شده اند که دارای عملکرد دوگانه هستند ،هم سطح میکروکانال را می پوشانند و هم به عنوان پلیمرهای غربالگر موثر عمل میکنند.پلی دی متیل اکریلامید (polydimethylacrylamide=PDMA) و پلیمرهای سلولوزیک ، هیدروکسی اتیل سلولوز (hydroxyethyl cellulose) و هیدروکسی پروپیل سلولوز (hydroxypropyl cellulose) در این رابطه بسیار موثر عمل کرده اند.
در عمل از میکروچیپ الکتروفورز به طور گسترده ای در تشخیص مولکولی بیماری ها به وسیله طرح های ابتدایی میکروچیپ استفاده شده است، به عنوان مثال در تشخیص یک محصول PCR دارای ارزش تشخیصی.این توانایی در شماری از کاربردهای تشیخیصی به اثبات رسیده است شامل 1) DNA ویروس هرپس سیمپلکس در CSF در تشخیص انسفالیت 2) باز آرایی ژنی مرتبط با بیماریهای لیمفوپرولیفراتیو 3) پلیمرفیسم (چند شکلی ) در ژن انزیم متیلن تتراهیدروفولات ردوکتاز 4) تکرارهای چهار نوکلئوتیدی مرتبط با هایپرکلسترولمی و 5) تشخیص سندرم کروموزوم X شکننده و 6) دیستروفی عضلانی
یک نمونه از جداسازی DNA به وسیله میکروچیپ در تشخیص اختلالات لیمفوپرولیفراتیو بکار رفته که در شکل 12-11 نشان داده شده است.slab gel اکریلامید (8%) با قدرت جداسازی بالا در آنالیز معمول به عنوان مقایسه در سمت چپ نشان داده شده است.برای قابل مقایسه بودن طول جداسازی کوتاه در اتاق الکتروفورزی (= 4 cm) و میدان الکتریکی بکار رفته با آنچه که در جداسازی به وسیله الکتروفورز مویین بکار میرود ، جداسازی در میکروچیپ در 160 ثانیه به پایان میرسد (در مقایسه با 8 ساعت در slab gel).
منبع:تیتز پایه های شیمی بالینی و تشخیصهای مولکولی،ویرایش پنجم،فصل دوازدهم
,Tietz; textbook of clinical chemistry and molecular diagnostics ,fifth edition,chapter12
