انتخاب متد و ارزیابی تحلیلی متدهای تشخیصی

مقدمه 

انتخاب متدهای تشخیصی جدید و یا اصلاح شده پدیده ای است که در ازمایشگاههای بالینی معمول است . انتخاب و ارزیابی متد دو گام کلیدی در پایه گذاری یک متد تشخیصی محسوب میشوند . و قبل از اینکه این متد ها مورد مصرف معمول قرار بگیرند می بایست به دقت انتخاب شوند و از نظر عملکردی کاملا بررسی شوند .هنگامی که قرار است یک متد جهت مصرف معمول ازمایشگاههای بالینی عرضه شود شاخص های متعددی باید مورد ارزیابی قرار گیرند مانند عدم دقت متد ، محدوده قابل اندازه گیری و تعیین حد تشخیص پایین و بالای آن ، ارزیابی عوامل مداخله گر در متد ، و مقایسه این متد جدید با متد موجود می بایست انجام گیرد. بسته به وضعیت ممکن است یک ارزیابی و تایید محدود برای یک تولید کننده و ارایه کننده متد کافی باشد و چنانچه اگر یک متد کاملا تازه تعریف شده است می بایست اعتبار سنجی کامل (full validation) به عنوان مثال در ارتباط با مقادیر مرجع (reference values) و حدود تصمیم گیری پزشکی(medical decision limits) صورت پذیرد.

ارزیابی متدها در ازمایشگاههای بالینی قویا تحت تاثیر دستورالعمل های راهنما (guidlines) است. موسسه استانداردهای ازمایشگاهی و بالینی (clinical and laboratory standards institute) که قبلا به آن کمیته ملی برای استانداردهای ازمایشگاههای بالینی (national committee for clinical laboratory standards) می گفتند دستورالعمل هایی را بدین منظور منتشر کرده است ، همچنین سازمان بین المللی استانداردها (international organisation for standardisation) نیز اسنادی را در این رابطه عرضه کرده است . در ادامه به فرایند انتخاب یک متد و نحوه ارزیابی آن می پردازیم.

منبع:تیتز پایه های شیمی بالینی و تشخیصهای مولکولی،ویرایش پنجم،فصل دوم

,Tietz; textbook of clinical chemistry and molecular diagnostics ,fifth edition,chapter2

انتخاب متد

انتخاب متد گامی حیاتی است در مراقبت از بیمار و پیشرفت در درمان بیماری بستگی زیادی به متدهای تشخیصی جدید و یا بهبود یافته دارد. مدت زمان مورد نیاز برای انجام متد تشخیصی و کاربرد بالینی متد معمولا توسط ازمایشگاهیان و پزشکان تعیین میشود. وقتی که متد مشخص شد می بایست شاخص های عملکردی متد شامل حساسیت و اختصاصیت مورد بررسی های ازمایشگاهی قرار گیرد. در این ارتباط می بایست ملاحظات دیگری همچون دقت کافی ، صحت ، محدوده قابل اندازه گیری و عوامل مداخله گر باید صورت گیرد.

معیارهای کارایی انالایتیکال (Analytical performance)

در ارزیابی کارایی یک متد ، دقت (Precision) - صحت (Accuracy) - محدوده قابل اندازه گیری (Analytical range) - پایین ترین حد قابل اندازه گیری (Detection limit) و اختصاصیت اندازه گیری (Analytical specificity) دارای اهمیت ویژه ای است .معیارهای دیگری که مورد توجه باید قرار گیرد شامل 1- اصول متد و مراجع مربوطه 2- جزییات روش انجام متد 3- مواد تشکیل دهنده ریاجنتها و مواد مرجع و شرایط نگه داری آنها (مانند فضا ، نور، دما ، رطوبت ) 4- پایداری ریاجنتها و مواد مرجع 5- خطرات احتمالی و در نظر داشت ایمنی مناسب 6- الزامات نمونه (شرایط جمع آوری ، نگه داری ، حمل و نقل ، حجم مورد نیاز ، نیاز به ضد انعقاد خاص ) 7- تعیین محدوده مرجع  8- کم هزینه بودن می باشد.

مفاهیم پایه در ارتباط با متدهای انالایتیکال 

این مفاهیم شامل 1- کالیبراسیون 2- صحت 3-دقت 4-خطی بودن 5- حد پایین تشخیص 6- حد بالای اندازه گیری 7-اختصاصیت و موارد دیگر می باشد.

کالیبراسیون (Calibration)

تابع کالیبراسیون عبارتست از ارتباط بین سینگنال (Y) تجهیز (Instrument) و غلظت (x) ماده مورد اندازه گیری (Analyte) که به صورت زیر تعریف میشود 

                                                                                           (Y=f(x

این ارتباط با اندازه گیری نمونه هایی با غلظت معلوم از انالیت (کالیبراتور) و سیگنال بدست امده برقرار میگردد.

تفاوت محلولهای دارای استاندارد خالص و نمونه های دارای مقادیر معلوم در ماتریکسی است که استفاده شده است. محلول های دارای استاندارد خالص در روش های مرجع مورد استفاده قرار میگیرند و اثرات ماتریکس بر آن بی تاثیر است در حالی که در نمونه های با مقادیر معلوم اثرات ماتریکس تاثیرگذار است و این نمونه ها می بایست با استانداردهای مرجع مربوط کالیبر گردد. منحنی کالیبراسیون ممکن است خطی ، منحنی و یا همانند منحنی های استاندارد در سنجش های ایمنی تابعی دارای چهار پارامتر باشد. چنانچه اگر تابع کالیبراسیون مورد نظر به درستی انعکاس دهنده بین سیگنال تجهیز و غلظت انالیت نباشد بنابراین ما شاهد یک خطای سیستماتیک(Systematic error) در متد تشخیصی هستیم به عنوان مثال در پدیده اثر هوک (Hook Effect) در واکننشهای ایمنی ما شاهد هستیم که با وجود غلظتهای بالای انالیت سیگنال مشاهده شده بسیار پایین است.

صحت (Accuracy)

صحت طبق تعریف ISO به صورت میزان نزدیک بودن مقدار یک اندازه گیری با غلظت واقعی انالیت تعریف میشود. به میزان اختلاف بین مقدار میانگین با مقدار واقعی بایاس (Bias) گفته میشود که با عدد بیان شده و بطور معکوس با صحت ارتباط دارد به این معنی که هر چه این عدد کوچکتر باشد صحت بیشتر و هر چه بزرگتر باشد صحت کمتر است. صحت با استفاده از اندازه گیری انالیت با روش جدید(new method)  و یا معمول (routine method) و مقایسه آن با روش اندازه گیری مرجع (reference method) ارزیابی می شود. طبق تعریف صحت (accuracy) متاثر از Bias و عدم دقت (imprecision) است و یک واژه کیفی است که بصورت معکوس با میزان عدم اطمینان  (uncertainity) اندازه گیری ارتباط دارد و قابل اندازه گیری و بیان کمی است .

مفاهیم دیگری نیز با صحت در ارتباط هستند شامل بازیافت (recovery) ، دریفت (drift) و کری اور (carryover) . ریکاوری عبارتست از بخش یا درصد افزایش در غلظت است که در ارتباط با مقدار اضافه شده اندازه گیری میشود. ریکاوری بیشتر در زمینه انالیز داروها استفاده میشود. در نوعی از ریکاوری به نام ریکاوری استخراج (extraction recovery) از یک استاندارد داخلی جهت جبران اتلاف ها در حین فرایند استخراج استفاده میشود و تنها از این نظر با ریکاوری به معنای عمومی آن تفاوت دارد. ریکاوری با مقدار 100% یک پیش نیاز برای صحت یک متد تشخیصی است اما عدم صحت را تضمین نمی کند چرا که وجود عوامل مداخله گر که سبب واکنش های غیر اختصاصی با ماتریکس میگردند در ازمایش ریکاوری تشخیص داده نمی شوند. drift به وسیله عدم پایداری تجهیز در گذر زمان ایجاد میشود و در نتیجه کالیبراسیون را منحرف میکند.carryover نیز باید نزدیک به صفر باشد تا نتایج صحیح را تضمین کند. drift و carryover به راحتی توسط دستورالعمل ارزیابی چند عاملی (multifactorial evaluation protocol) منتشر شده توسط CLSI قابل تخمین است .

دقت (precision)

دقت عبارتست از میزان نزدیک بودن اندازه گیری های مستقل انجام شده که تحت شرایط قراردادی بدست امده اند.میزان دقت معمولا بر پایه شاخص های اماری مانند SD و CV بیان میشود که بزرگی آنها با دقت رابطه معکوس دارد.عدم دقت اندازه گیری ها تنها بستگی به خطای تصادفی اندازه گیری ها داشته و هیچ ارتباطی با صحت اندازه گیری ها ندارد. دقت را به دو شکل زیر تقسیم بندی میکنند تکرار پذیری (repeataability) به مفهوم میزان نزدیک بودن اندازه گیری های متوالی انجام شده تحت شرایط یکسان (که به آن within run precision  یا intraassay precision هم گفته میشود) و بازتولید پذیری (reproduceability) به معنی میزان نزدیک بودن نتایج اندازه گیری ها تحت شرایط تغییر یافته (مانند دما ، انجام دهنده ازمایش ، کالیبراتور و ریاجنتهای با سری متفاوت تولید ). 

پروفایل دقت (precision profile) : دقت اغلب وابسته به غلظت انالیتی دارد که اندازه گیری میشود . بیان دقت بصورت تابعی از غلظت انالیت مورد اندازه گیری را پروفایل دقت آن متد می نامند، که بصورت نموداری از SD یا CV  بصورت تابعی از غلظت انالیت مورد اندازه گیری قابل ترسیم است .

خطی بودن (Linearity) 

خطی بودن عبارتست از ارتباط بین مقدار اندازه گیری شده(measured value) با مقدار مورد انتظار (expected value) در سرتاسر محدوده قابل اندازه گیری. خطی بودن ممکن است در ارتباط با غلظت واقعی انالیت و یا غلظت نسبی انالیت سنجیده شود . خطی بودن یک پیش الزام برای صحت می باشد.

محدوده اندازه گیری انالایتیکال و حدود تعیین مقدار

محدوده اندازه گیری انالایتیکال (فاصله اندازه گیری ، محدوده قابل گزارش) محدوده ای از غلظت انالیت است که در آن محدوده ،نتایج اندازه گیری ها  در حدود اعلام شده عدم دقت و عدم صحت متد تشخیصی قرار میگیرد. حد پایین تشخیص از نظر پزشکی در موزد بسیاری از انالیت ها دارای اهمیت است به عنوان مثال در اندازه گیری هورمون TSH پایین اوزدن حد پایینی تشخیص سبب بهتر تفکیک شدن نتایج از حد پایین محدوده مرجع شده و در نتیجه باعث تشخیص بهتر وضعیت هایپرتایروییدیسم میشود.

حد تشخیص (limit of detection) شاخصه مهم دیگری از یک متد به حساب میاید. حد تشخیص به صورت کمترین مقدار قابل تفکیک از مقدار نمونه عاری از انالیت تعریف میشود. بنابراین این حد تشخیص با اندازه گیری های مکرر نمونه عاری از انالیت و گزارش نتیجه به صورت میانگین به اضافه دو یا سه برابر انحراف معیار نتایج در نظر گرفته میشود.

حساست انالایتیکال (analytical sensitivity)

حساسیت به توانایی تشخیص تغییرات کوچک در غلظت انالیت مورد اندازه گیری توسط متد تشخیصی گفته میشود. هرچه نوسانات تصادفی در سیگنال تجهیز کمتر باشد و هر چه شیب منحنی کالیبراسیون در یک نقطه مفروض بیشتر باشد تغییرات کوچک در غلظت انالیت بهتر تشخیص داده میشود .در واقعیت حساسیت انالایتیکال بستگی کامل به دفت متد دارد.

اختصاصیت انالایتیکال (analytical specificity) و تداخل (interference)

به توانایی متد تشخیصی در شناسایی و تعیین مقدار  انالیت هدف گفته میشود بطوری که تاثیری از مواد مداخله گر یا عوامل موجود در ماتریکس انالیت نپذیرد ( چون هیپرلیپمی ، همولیز ، بیلی روبین ، انتی بادی ها ، مواد با منشا خارجی، سایر متابولیت ها و محصولات حاصل از تخریب انالیت)

تداخل ناشی از هایپرلیپمی ، همولیز و بیلی روبین عموما وابسته به غلظت است و می توان بصورت تابعی از غلظت آنها را محاسبه کرد . در سنجش دارو ها تداخل به متابولیتهای داروها نیز مرتبط است و در بعضی موارد که میزان تداخل قابل ملاحظه است می بایست این مقادیر نیز به حساب ایند.دستورالعملی با جزییات کامل توسط CLSI در رابطه با ارزیابی تداخل منتشر شده است .

در مورد پروتیین ها و پپتیدها انتی بادی ها جهت تشخیص اختصاصی بکار گرفته میشوند اما انتی بادی های تولید شده علیه اپی توپهای متفاوتی از مولکول پپتیدی یا پروتیینی تولید میشوند .  پروتیین هورمون ها معمولا به اشکال مختلف مولکولی وجود دارند و اختصاصیت متفاوت انتی بادی ها علیه این هورمونها سبب نتایج پراکنده در رابطه با تشخیص و اندازه گیری هورمونها میتواند شود . در مواردی که ظن به وجود تداخل در اندازه گیری است می توان از ریاجنتهای بلاک کننده انتی بادی های هتروفیل که عامل تداخل در سنجشهای بر پایه ایمنی محسوب میشوند و یا از مطالعات رقیق سازی که یک رقیق سازی سریالی با نتایج نامرتبط نشانده وجود تداخل است استفاده کرد.

متدهای کیفی (qualitative methods)

متدهایی هستند که جهت تعیین بالاتر یا پایینتر بودن نتایج از یک مقدار از قبل تعریف شده به نام مقدار کات آف ( cutt off value) مورد استفاده قرار میگیرند و در حال حاضر بیشتر تحت عنوان point of care testing در تشخیص های بالینی ،رو به گسترش هستند. 

سنجش کارایی (performance measures)

به میزان احتمال دسته بندی یک نتیجه به عنوان مثبت (نتیجه ای که از مقدار cut off بیشتر است ) هنگامی که مقدار واقعی نیز از مقدار cut off بیشتر است حساسیت بالینی (clinical sensitivity) یا حساسیت تشخیصی (diagnostic sensitivity) گفته میشود. و همینطور به میزان احتمال دسته بندی یک نتیجه به عنوان منفی (نتیجه ای که از مقدار cut off کمتر است ) هنگامی که مقدار واقعی نیز کمتر از مقدار cutt off است اختصاصیت بالینی (clinical specificity) یا اختصاصیت تشخیصی (diagnostic specificity) گفته میشود. تعیین میزان حساسیت بالینی و اختصاصیت بالینی در مقایسه با یک روش استاندارد طلایی (gold standard) یا بعبارتی یک استاندارد مرجع صورت میگیرد. استاندارد طلایی نیز یک روش مستقل تشخیصی است که همان انالیت را می سنجد اما با متد های تشیخص بالینی قطعی. حساسیت بالینی و اختصاصیت بالینی بصورت کسر یا درصد بیان میشود .

هم خوانی بین متدهای کیفی 

همانطوری که قبلا بیان شد وقتی که برون ده یک متد کیفی در ارتباط با یک مقدار واقعی انالیت  و یا یک تشخیص بالینی قطعی است بهتر است که که کارایی متد را بصورت حساسیت و اختصاصیت بالینی بیان کنیم.هنگامی که یک روش مرجع و یا استاندارد طلایی وجود ندارد می بایست در مورد تعیین کارایی متد بسیار هوشیار بود. در این مورد حداقل بهتر است با یک متد موجود دیگر مقایسه شود.هنگامی که قرار است یک متد قدیمی و گران با یک متد جدید و ارزان جایگزین شود می بایست حداقل نتایج مشابهی دریافت کنیم اما اگر از نظر برون ده نتایج هر دو متد عالی نیستند می باییست با یک متد مرجع مقایسه شوند.

در مطالعه مقایسه ای دو متد کیفی از بیماران یکسانی استفاده میشود تا بدین ترتیب انحرافی ناشی از عامل متغیر بیماران در محاسبه وارد نشود.  نتیجه مقایسه دو متد کیفی اساسا بصورت یک جدول 2*2 ارایه میشود که از آن شاخصی های مقایسه ای مختلفی را میتوان استخراج کرد.

منبع:تیتز پایه های شیمی بالینی و تشخیصهای مولکولی،ویرایش پنجم،فصل دوم

,Tietz; textbook of clinical chemistry and molecular diagnostics ,fifth edition,chapter2